[發(fā)明專利]一種簡便、高效且通用的植物葉綠體基因組測序方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710062510.5
• 申請(qǐng)日: 2017-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN106834465A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶小軍;宋衛(wèi)寧;鄧平川;崔立操;卞建新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G06F19/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種簡便、高效且通用的植物葉綠體基因組測序方法。

背景技術(shù)

葉綠體是綠色植物細(xì)胞內(nèi)所特有的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行光合作用的場所，是一切能量的最初來源。葉綠體擁有自身的DNA和遺傳體系，與生物進(jìn)化與及細(xì)胞起源有很密切關(guān)系，葉綠體基因組是分子進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育和分子標(biāo)記領(lǐng)域的重要研究對(duì)象，而獲得目的生物的葉綠體基因組全序列，則成為該領(lǐng)域研究人員的首要目標(biāo)。傳統(tǒng)的植物葉綠體基因組測序通常采用通用引物長鏈PCR或是葉綠體基因組文庫的葉綠體基因組測序策略，一般都要求大量新鮮材料、提取較高純度的葉綠體DNA，操作步驟多，流程復(fù)雜，周期長，而且分離高純度的葉綠體DNA需要根據(jù)不同植物物種的特性優(yōu)化體系，難度較大，通用性差，往往成為葉綠體基因組測序的限制因素。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種簡便、高效且通用的植物葉綠體基因組測序方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種簡便、高效且通用的植物葉綠體基因組測序方法，包括如下步驟：

S1、直接分離、純化植物葉片的基因組DNA

為保證基因組DNA有足夠的葉綠體DNA，將植株在強(qiáng)光下曝光2天后，選擇較深綠色的葉片100mg，利用常規(guī)微量DNA提取方法(如CTAB)提取葉片的基因組DNA(不用預(yù)先分離葉綠體，再提取葉綠體DNA等繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟)，保存于低溫備用；

S2、基因組DNA的高通量文庫構(gòu)建及測序

取上述提取的基因組DNA 5ug，采用超聲波進(jìn)行物理隨機(jī)打斷或者dsDNA水解酶進(jìn)行酶切，然后用MinEITte PCR回收試劑盒(Qiagen，德國)回收片段化的葉綠體DNA，再將片段化的DNA末端補(bǔ)齊，并加上測序接頭，用MinElute PCR回收試劑盒回收加上接頭的DNA，電泳并利用膠回收試劑盒(Tiangen，China)回收200-500bp的片段，PCR擴(kuò)增回收片段構(gòu)建測序文庫；測序文庫構(gòu)建和測序反應(yīng)采用IIITmina公司的標(biāo)準(zhǔn)程序(IIIumina，USA)，測序平臺(tái)為IIIumina Hiseq4000，文庫大小為300bp，測序策略為PE150(測序平臺(tái)和策略可隨意調(diào)整，適用于任意高通量測序平臺(tái))；

S3、測序數(shù)據(jù)的預(yù)處理

測序后采用IIIumina HCS 1.1軟件進(jìn)行測序圖像的轉(zhuǎn)換及質(zhì)量值計(jì)算，將圖像信息轉(zhuǎn)變?yōu)樾蛄行畔ⅲ缓笕コd體序列、低質(zhì)量序列獲得可用于候選分析的測序數(shù)據(jù)；然后從NCBI下載其所收錄的所有植物葉綠體基因組序列(ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/plastid)作為參考序列，將獲得的測序數(shù)據(jù)利用botwie軟件進(jìn)行基因組映射，具體命令為bowtie2--al-conc alconc--un-conc unconc--un unpaired--al aligned-x all_plant_chloroplast_sequence-1 clean_data_P1-2 clean_data_P2-sout.sam，將能比對(duì)上參考基因組的左右兩端序列分別放入到mapped_reads_p1和mapped_reads_p2文件中，用于候選的葉綠體基因組組裝(數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)化)；

S4、葉綠體基因組的組裝和拼接

對(duì)上述步驟得到mapped reads數(shù)據(jù)集，利用soapdenovo軟件對(duì)得到的reads進(jìn)行從頭拼裝得到序列contigs，然后利用Pair-end關(guān)系對(duì)contigs進(jìn)行連接，再用gapcloser進(jìn)行補(bǔ)洞，得到scaffold序列，然后再用所有mapped reads映射(mapping)所有scaffold，再一次填補(bǔ)空缺(gap)位置；同時(shí)，選擇與目標(biāo)物種近緣關(guān)系最近的已測序的葉綠體為參考，利用MAQ軟件將mapped reads對(duì)參考基因組進(jìn)行映射(mapping)，得到一條一致序列(Consensus sequence)。然后利用blat工具將拼接得到的scaffold序列按照參考基因組進(jìn)行排序，空缺區(qū)域用consensus序列對(duì)應(yīng)位置填補(bǔ)，得到葉綠體基因組的草圖；最后，再用所有mapped reads映射(mapping)草圖，補(bǔ)可能的空缺位置，最終得到葉綠體基因組精細(xì)圖；(采用高通量測序可以十分經(jīng)濟(jì)的方式獲得超高深度覆蓋度的測序結(jié)果，拼接操作十分簡單而且準(zhǔn)確度高)。

S5、葉綠體基因組的驗(yàn)證和評(píng)估