[發明專利]一種簡便、高效且通用的植物葉綠體基因組測序方法

在審

• 申請號: 201710062510.5
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN106834465A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 聶小軍;宋衛寧;鄧平川;崔立操;卞建新
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G06F19/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種簡便、高效且通用的植物葉綠體基因組測序方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、直接分離、純化植物葉片的基因組DNA

將植株在強光下曝光2天后，選擇較深綠色的葉片100mg，利用常規微量DNA提取方法提取葉片的基因組DNA，保存于低溫備用；

S2、基因組DNA的高通量文庫構建及測序

取上述提取的基因組DNA 5ug，采用超聲波進行物理隨機打斷或者dsDNA水解酶進行酶切，然后用MinElTte PCR回收試劑盒回收片段化的葉綠體DNA，再將片段化的DNA末端補齊，并加上測序接頭，用MinElute PCR回收試劑盒回收加上接頭的DNA，電泳并利用膠回收試劑盒回收200-500bp的片段，PCR擴增回收片段構建測序文庫；測序文庫構建和測序反應采用IIITmina公司的標準程序，測序平臺為IIIumina Hiseq4000，文庫大小為300bp，測序策略為PE150；

S3、測序數據的預處理

測序后采用IIIumina HCS 1.1軟件進行測序圖像的轉換及質量值計算，將圖像信息轉變為序列信息，然后去除載體序列、低質量序列獲得可用于候選分析的測序數據；然后從NCBI下載其所收錄的所有植物葉綠體基因組序列作為參考序列，將獲得的測序數據利用botwie軟件進行基因組映射，具體命令為bowtie2--al-conc alconc--un-conc unconc--un unpaired--al aligned-x all_plant_chloroplast_sequence-1 clean_data_P1-2 clean_data_P2-s out.sam，將能比對上參考基因組的左右兩端序列分別放入到mapped_reads_p1和mapped_reads_p2文件中，用于候選的葉綠體基因組組裝；

S4、葉綠體基因組的組裝和拼接

對上述步驟得到mapped reads數據集，利用soapdenovo軟件對得到的reads進行從頭拼裝得到序列contigs，然后利用Pair-end關系對contigs進行連接，再用gapcloser進行補洞，得到scaffold序列，然后再用所有mapped reads映射所有scaffold，再一次填補空缺位置；同時，選擇與目標物種近緣關系最近的已測序的葉綠體為參考，利用MAQ軟件將mapped reads對參考基因組進行映射，得到一條一致序列；然后利用blat工具將拼接得到的scaffold序列按照參考基因組進行排序，空缺區域用consensus序列對應位置填補，得到葉綠體基因組的草圖；最后，再用所有mapped reads映射草圖，補可能的空缺位置，最終得到葉綠體基因組精細圖；

S5、葉綠體基因組的驗證和評估

首先，將組裝獲得的葉綠體基因組與多個近緣或者同一科的不同葉綠體基因組進行多序列比對，鑒定基因組的變異熱點區域，判斷可能出現拼接錯誤的位置；然后，根據拼接得到的葉綠體基因組，隨機選擇4-5處序列設計引物，重點針對可能出現錯誤的位置，PCR擴增后sanger測序，然后利用ClustalW軟件將測序結果與拼接的葉綠體基因組序列進行比對，根據比對結果驗證拼接的準確性和可靠性；

S6、葉綠體基因組的利用

利用在線分析軟件DOGMA進行葉綠體的注釋；利用MAUVE軟件分析葉綠體基因組的結構差異，利用采用mVISTA工具對分析不同葉綠體全基因組的序列差異并尋找潛在的候選分子進化分析的位點；采用MEGA和PAML進行系統進化和分子選擇分析。