[發明專利]一種中華大蟾蜍溶菌酶

在審

• 申請號: 201710062396.6
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN107043758A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: 高飛;錢永常
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N15/56
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種中華大蟾蜍溶菌酶。

背景技術

抗生素濫用在當今世界引發的生態環境災難以及它們導致的對人類健康的影響已經越來越引發世界的關注。尋找活性更好和特異性更高的抗生素替代品成為當務之急的事情，因此，具有抗菌活性的多肽類物質-抗菌肽(AMP)成為新的研究熱點，其中，以Maganin為代表的兩棲動物源AMP尤其引人矚目。兩棲類動物皮膚分泌物的研究多集中在多肽類物質的鑒定和功能上。如非洲爪蟾Xenopys laevis的抗菌多肽Magainin及中國大蹼鈴蟾Bombina maxima的抗菌多肽Maximin在極低濃度就對腫瘤細胞顯示殺傷作用，并且它們可選擇性地作用于腫瘤細胞而對機體正常組織細胞無影響。此外還有更多的兩棲類皮膚分泌多肽在很低濃度水平就顯示強大而廣譜的抗菌活性，如中國大蹼鈴蟾的抗菌肽Maximin3在1.5μg/mL的含量水平時就可以完全抑制大腸桿菌、巨大芽孢桿菌Bacillus magaterium以及痢疾桿菌Shigella dysenteriae的生長。也有一些肽類對肌體具有一定的副作用，如中國大蹼鈴蟾的Maximin H抗菌肽、日本沼蛙的Brevinin-1抗菌肽以及東方鈴蟾Bombintoro rientalis的Bombinin H抗菌肽均具有很強的溶血活性。因此，兩棲類動物的皮膚分泌多肽是一類多樣性極為豐富且功能非常顯著的活性物質，極具研究價值和廣闊的應用前景。

中華大蟾蜍皮膚分泌物經干制后稱為蟾酥，是我國傳統中藥，在我國歷史上長期用于強心、麻醉、抗菌消炎、止咳等用途，進而發現蟾酥具有抑制腫瘤的功效。現代藥理學研究發現蟾酥中含有的強心甾體化合物和吲哚生物堿類化合物對腫瘤細胞具有較強的細胞毒性和抑制活性，并陸續發現了蟾毒靈、華蟾毒精等具有抗腫瘤活性的單體化合物。近期，來源自中華大蟾蜍的cathelicidin-Bg被報道具有抗革蘭氏陽性細菌活性，這是首次報道來源中華大蟾蜍的活性抗菌多肽。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種中華大蟾蜍溶菌酶，該溶菌酶重組表達產物對兩種革蘭氏陽性細菌、兩種革蘭氏陰性細菌和兩種真菌生長的抑制。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種中華大蟾蜍溶菌酶，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

該溶菌酶重組表達產物對兩種革蘭氏陽性細菌、兩種革蘭氏陰性細菌和兩種真菌生長具有抑制作用。

其中，所述溶菌酶重組表達產物通過以下步驟合成：

S1、用TRlzol試劑法提取中華大蟾蜍的腺體組織的總RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO，Japan)反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA；

S2、用添加酶切位點的引物

5’-CCGGAATTCAAGTATGAAAAATGCGAACTTGCTA-3’和

5’-CCCTTCGAATTAAAGTTTGCATCCTTGAGTCCA-3’為引物；

以以上步驟合成的cDNA為模板擴增中華大蟾蜍溶菌酶功能域編碼序列片段；

S3、將克隆片段用DNA純化試劑盒進行純化，純化后的DNA片段與pET-28空質粒均用EcoR I和Hind III進行雙酶切，反應條件是37℃放置8h；反應結束后將酶切產物再次用DNA純化試劑盒進行純化，并將純化后的DNA片段和pET-28空質粒的片段用T4 DNA連接酶進行連接。

本發明具有以下有益效果：

該溶菌酶重組表達產物對兩種革蘭氏陽性細菌、兩種革蘭氏陰性細菌和兩種真菌生長具有抑制作用。

附圖說明

圖1為本發明實施例中溶菌酶的抑菌實驗結果。

具體實施方式

為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

以下實施例中，所使用的中華大蟾蜍(100-130g)采集自杭州市臨安，將耳后皮膚腺用75％的乙醇進行表面消毒，然后解剖其中的腺體組織。

實施例

用TRlzol試劑法提取中華大蟾蜍的腺體組織的總RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO，Japan)反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA；

用添加酶切位點的引物