[發明專利]抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料及其制備方法和在細胞捕獲中的應用

在審

• 申請號: 201710062302.5
• 申請日: 2017-02-02
• 公開（公告）號: CN106801040A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 高明霞;張珮明;張祥民
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C01B32/194
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司31200
• 代理人: 陸飛,陸尤

技術領域

本發明屬于生物大分子分離分析技術領域，具體涉及一種抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料及其制備方法及和在細胞捕獲中的應用。

背景技術

近年來對于腫瘤細胞分離的研究受到了極大地關注。研究表明，不同種類的腫瘤細胞可以被用作預測標志物，而對它們的檢測可以反映出實體腫瘤的轉移、復發和進展，有利于腫瘤的及時發現、及早診斷和有效治療，因此發展出高效率、高靈敏度的方法分離腫瘤細胞就成為關鍵步驟，為其后續檢測提供了無限可能。

隨著人們對腫瘤細胞分離研究的不斷深入，涌現出了種類繁多的新技術和新方法用于捕獲和檢測腫瘤細胞。根據分離機理的不同，這些新技術新方法可以分為物理分離和生物親和分離：物理分離法富集腫瘤細胞主要利用的是腫瘤細胞的尺寸、密度和變形性不同于正常血細胞，這種方法簡單便捷，但是特異性和靈敏度均較差，限制了其實際應用；生物親和分離法富集腫瘤細胞則是通過引入抗體、適配體等可與細胞膜表面特異性作用的生物分子來實現，此方法效率高、特異性強、對細胞損傷小，更具有實際應用價值。免疫磁球具有易合成、易分離的優勢，是細胞捕獲的優良基底，通過對免疫磁球的修飾可改善其性能，有利于實現高選擇性和高靈敏度的細胞捕獲。

為達到高效快速分離腫瘤細胞并降低非特異性吸附對捕獲干擾的目的，本發明設計并制備了一種抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料，大大提高了材料的親水性和抗體的修飾量，石墨烯薄膜的平面結構大大降低了材料的非特異性吸附作用，保證了材料的高效捕獲和特異性識別，具有巨大的臨床應用前景。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高選擇性和高靈敏度的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料及其制備方法和在細胞捕獲中的應用。

本發明提供的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料，為均勻固定在雙面膠上的二維石墨烯薄膜，殼聚糖與樹枝狀大分子通過交聯反應分步修飾于薄膜表面，最后通過碳二亞胺交聯法將anti-EpCAM抗體偶聯，即得到功能化的薄膜材料。其中，作為基底的石墨烯薄膜，結合了石墨烯的理化特性與平面基底相對于納米材料具有低吸附性的特點。本發明材料通過引入含128個伯氨基的樹枝狀分子，大大增強了抗體的修飾量，從而達到特異性識別和高效捕獲的目的，同時殼聚糖與樹枝大分子均為親水分子，使得材料具備超親水性；利用抗原-抗體的特異性結合，將目標細胞成功分離。

本發明提出的抗體修飾的親水石墨烯薄膜的制備方法，首先，將石墨烯薄膜利用粘附性均勻固定于雙面膠基底；然后，通過偶聯反應包覆一層殼聚糖，再將樹枝狀分子（PAMAM dendrimer 5.0）通過戊二醛交聯法與殼聚糖枝接；最后，將抗體通過碳二亞胺共價偶聯的方法修飾于石墨烯薄膜材料表面，形成具有免疫識別和捕獲功能的薄膜材料。

本發明提出的抗體修飾的親水石墨烯薄膜的制備方法，具體步驟如下：

（1）石墨烯薄膜基底合成：裁切1.2*1.2 cm²的雙面膠，平鋪粘貼于24孔板的一孔中，向每孔加入400-600 μL的0.5-2.0 mg/mL石墨烯乙醇溶液，置于搖床中，30-40℃，反應16-24 h后用乙醇和水交替清洗材料，得到均勻分散的石墨烯薄膜基底材料；

（2）殼聚糖包覆的石墨烯薄膜材料的合成：向步驟（1）制備的石墨烯薄膜材料中加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的混合溶液300-500 μL，于30-37℃活化羧基0.3-1.0 h，EDC與NHS用量比為1:1-1:2，然后向活化后的材料加入50-150 μL殼聚糖的醋酸溶液，醋酸濃度為1%-3%，殼聚糖濃度為5-10 mg/mL，反應12-16 h后，用PBS將材料洗凈，得到殼聚糖包覆的石墨烯薄膜材料；

（3）樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜的合成：采用戊二醛交聯法將樹枝狀分子修飾在殼聚糖包覆的石墨烯薄膜上，即：先用5%-25%戊二醛的PBS溶液，活化步驟（2）得到的殼聚糖包覆的石墨烯薄膜1-3 h，用PBS清洗后，加入0.5-4.0 μL的樹枝狀分子（PAMAM dendrimer5.0）溶液，30-37℃偶聯3-6 h，然后用含1%-2% 氰基硼氫化鈉的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用PBS洗凈，即得到樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜；