[發明專利]抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料及其制備方法和在細胞捕獲中的應用

在審

• 申請號: 201710062302.5
• 申請日: 2017-02-02
• 公開（公告）號: CN106801040A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 高明霞;張珮明;張祥民
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C01B32/194
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司31200
• 代理人: 陸飛,陸尤

1.一種抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料的制備方法，其特征在于，首先，將石墨烯薄膜利用粘附性均勻固定于雙面膠基底；然后，通過偶聯反應包覆一層殼聚糖；再將樹枝狀分子PAMAM通過戊二醛交聯法與殼聚糖枝接；最后，將抗體通過碳二亞胺共價偶聯的方法修飾于石墨烯薄膜材料表面，形成具有免疫識別和捕獲功能的薄膜材料。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體操作步驟如下：

（1）石墨烯薄膜基底合成：裁切1.2*1.2 cm²的雙面膠，平鋪粘貼于24孔板的一孔中，向每孔加入400-600 μL的0.5-2.0 mg/mL石墨烯乙醇溶液，置于搖床中，30-40℃，反應16-24 h后用乙醇和水交替清洗材料，得到均勻分散的石墨烯薄膜基底材料；

（2）殼聚糖包覆的石墨烯薄膜材料的合成：向步驟（1）制備的石墨烯薄膜材料中加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的混合溶液300-500 μL，于30-37℃活化羧基0.3-1.0 h，EDC與NHS用量比為1:1-1:2，然后向活化后的材料加入50-150 μL殼聚糖的醋酸溶液，醋酸濃度為1%-3%，殼聚糖濃度為5-10 mg/mL，反應12-16 h后，用PBS將材料洗凈，得到殼聚糖包覆的石墨烯薄膜材料；

（3）樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜的合成：采用戊二醛交聯法將樹枝狀分子修飾在殼聚糖包覆的石墨烯薄膜上，即：先用5%-25%戊二醛的PBS溶液，活化步驟（2）得到的殼聚糖包覆的石墨烯薄膜1-3 h，用PBS清洗后，加入0.5-4.0 μL的樹枝狀分子（PAMAM dendrimer 5.0）溶液，30-37℃偶聯3-6 h，然后用含1%-2% 氰基硼氫化鈉的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用PBS洗凈，即得到樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜；

（4）抗體的修飾：采用碳二亞胺共價偶聯的方法將上皮細胞粘附分子抗體（anti-EpCAM）修飾于表面為樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜上，即：首先配制得到濃度在5-20 μg/mL的抗體溶液，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS），再將上述混合溶液加入步驟（3）得到的樹枝狀分子修飾的親水薄膜材料中，25-37℃偶聯12-20 h，即可得到抗體修飾的樹枝狀分子親水石墨烯薄膜，其作為細胞捕獲的基底；其中：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的用量比為1:1-1:2。

3.一種如權利要求1或2所述制備方法得到的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料。

4.如權利要求3所述的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料，在捕獲前列腺癌細胞DU145、人宮頸癌細胞Hela中的應用。

5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，具體操作步驟為：向含抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料的24孔板的每孔中加入0.5 mL 腫瘤細胞DU145的懸浮液，細胞密度為10⁵-10⁶，在培養箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，計算細胞的捕獲效率；對捕獲后的細胞進行戊二醛固定，并經乙醇梯度脫水后，冷凍干燥，拍攝掃描電子顯微鏡觀察。

6.如權利要求3所述的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料，在捕獲細胞膜含抗體所對應抗原的腫瘤細胞中的應用。