[發明專利]一種肌肉干細胞的體外高效培養方法

在審

• 申請號: 201710062181.4
• 申請日: 2017-02-01
• 公開（公告）號: CN106854641A
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 沈露露;徐杰
• 申請（專利權）人: 徐州細力再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，涉及一種包括肌肉組織消化酶，肌肉細胞培養基和細胞培養板包被溶液的通用型肌肉干細胞體外培養試劑盒，屬于生物技術領域，特別涉及一種可以快速獲取并擴增肌肉干細胞，并保持肌肉干細胞的再生活力的方法。

背景技術

肌肉干細胞，即衛星細胞，是肌肉組織中存在于肌纖維的肌膜與基底膜之間，形態為小梭形扁平的單個核細胞。肌肉干細胞在肌肉組織受損，肌纖維發生斷裂的情況下被激活，而后肌肉干細胞會大量增值，并且相互融合形成再生型肌纖維，從而補充替代受損肌纖維。肌肉干細胞的這些功能，是肌肉組織維持穩定（homeostasis）和再生（regeneration）的基礎。骨骼肌再生障礙性疾病患者，肌肉干細胞的功能受損，而且其數量也下降，從而導致肌肉再生障礙。這類患者的肌肉組織無法維持正常的結構和功能，大量纖維組織代替了正常的肌肉組織，肌肉的正常結構被破壞，肌肉的力量也逐漸下降,從而嚴重影響患者生活水平，甚至危及生命。骨骼肌再生障礙性疾病是再生醫學所針對的一類典型疾病。這類疾病包括肌肉退行性病、外傷、衰老和癌癥惡液質等，影響著廣泛人群。再生醫學的目標，是恢復疾病組織和器官的正常功能和再生能力。肌肉干細胞治療的策略是投放肌肉干細胞來修復受損肌肉，進而扭轉上述疾病過程，甚至治愈疾病。而治療所投放的細胞需要具備兩個重要的功能：重建受損的肌肉纖維和補充肌肉內干細胞的數量。這樣才能實現恢復受損組織及其再生能力，也正是再生醫學的目的。

此外，以體外組織工程代表的生物技術，也需要大量的，具有再生能力的肌肉干細胞，這樣才能生成具有肌肉功能的人工組織，才能使下游工作例如藥物篩選，醫學發育組織學模型等成為可能。

細胞來源一直是肌肉組織干細胞治療的一個重大問題。治療一塊肌肉通常需要幾千萬到幾億細胞。這意味著要想獲得如此多的細胞，細胞擴增是必須的技術手段。從九十年代至今，已經有十數個臨床試驗使用這一策略，即獲取肌肉活檢，培養和大規模增殖肌肉來源的細胞，然后將這些細胞注入患者的肌肉組織。但是，這些臨床研究的一直無法得到顯著的治療效果，無論肌肉組織的結構恢復還是肌肉力量，都只有不顯著的、似是而非的改善。早期臨床試驗的問題一直到最近才被揭示出來。2005和2012 年的幾篇在Science 雜志發表的研究，已經闡明了基本的原因： 肌肉干細胞在體外培養中會迅速失去再生能力，例如在體內形成肌肉纖維的能力在5-8天的培養后即接近完全喪失。本來肌肉干細胞治療是希望注射入患者體內的細胞形成新的肌肉纖維并補充肌肉干細胞庫，從而達到重建受損的肌肉組織的目的。 但是已有的臨床試驗沒有意識到一個問題：即其所使用細胞培養技術無法保持骨骼肌干細胞的再生能力。這樣的細胞注入患者體內，自然無法有效產生新的肌肉纖維，自然無法達到所設想的治療效果。但直到今天，仍然可以檢索到19 項正在實施的，使用這種失去功能的細胞進行的臨床試驗。此外，市場上常見的提供肌肉干細胞的公司仍然在使用這種過時的，會使細胞失去再生能力的培養技術來生產細胞。對于使用這樣細胞的科研和臨床用戶，結果堪憂。

這一現象，顯示了在臨床治療和科研中對于肌肉干細胞干性保持方面認識上的不足，代表了肌肉再生醫學所必須面對和解決的一個重要問題。本發明即是為解決這一問題，為多種肌肉研究和臨床應用提供再生功能有保障的肌肉干細胞。體外的肌肉誘導分化使用同細胞培養相同的培養基。細胞生長至高聚合度后開始自然分化，形成多個核的肌管結構。培養基廣泛使用的肌肉培養方法例如Rando (1994)的方法，通常利用細胞貼壁能力的差異來提高肌肉前體細胞在培養中的純度，并且使用bFGF來維持肌肉前體細胞的性狀。我們發現上述的方法對于細胞干性的保持是有疑問的，例如上述這些方法無法保持細胞的Pax7表達，而這一蛋白是保持肌肉細胞體內外再生功能必不可少的。我們改變了培養方法，具體而言，培養基中含雞胚提取物，培養板也使用膠原蛋白包被。這一創新使得培養的細胞保持Pax7表達，并且在體外可以穩定形成肌管，體內可以形成再生型肌肉纖維。

發明內容

本發明一種肌肉干細胞的體外高效培養方法提供了一種小鼠肌肉干細胞的制備方法，采用該方法，可方便快捷地獲得大量的小鼠肌肉干細胞。這些細胞穩定表達肌肉干細胞標志物Pax7，保持體內體外再生活力，可以用于廣泛的應用領域，包括但不局限于細胞治療、組織工程、藥物篩選，以及肌肉發育和分子生物學研究。