[發明專利]一種肌肉干細胞的體外高效培養方法

在審

• 申請號: 201710062181.4
• 申請日: 2017-02-01
• 公開（公告）號: CN106854641A
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 沈露露;徐杰
• 申請（專利權）人: 徐州細力再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于包括下列步驟:（1）將離體并剪碎的小鼠肢體骨骼肌加入組織消化液，在37°C孵育2小時, 1000rpm離心5min，去上清，得經消化解離的組織和細胞；（2）經消化的組織按體積比1:10加入血清以終止酶消化；1000rpm離心5min,去上清；（3）經消化的組織置于膠原蛋白包被的培養皿中，并加肌肉干細胞培養基，在37℃，5%C0₂的培養箱中培養；（4）當肌肉干細胞生長到70-80%豐度時，收獲細胞，用于細胞傳代或下游應用。

2.如權利要求1所述的一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于所述組織消化液由0.2%I型膠原酶，肌肉干細胞培養基由DMEM，20%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，1% 雞胚提取物組成。

3.如權利要求1或2所述的一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于所述組織消化液的配制方法包括以下步驟：（1）稱量0.1克I型膠原酶；（2）充分溶解于50毫升無血清DMEM培養基中；（3）使用無菌濾膜過濾；（4）濾液保存在4°C。

4.如權利要求1所述的一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于所述膠原蛋白包被液含 5 mg/ml的I型鼠尾膠原蛋白。

5.如權利要求1所述的一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于所述原代肌肉干細胞培養基的配制方法包括以下步驟：在385 ml DMEM中加入100 ml FBS, 5 ml 青霉素和鏈霉素，10 ml 雞胚提取物組成，混勻，無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。

6.如權利要求4所述的一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于所述I型膠原酶余量為無血清DMEM培養基，pH=7.5-7.8。

7.如權利要求1-6任一所述的一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于適用于從正常野生型小鼠、基因敲除小鼠和轉基因小鼠中分離和分化肌肉干細胞。

8.如權利要求7所述的一種肌肉干細胞的體外高效培養方法，其特征在于所使用的小鼠為成年的8-12周小鼠。