[發明專利]用于檢測豬復陰后圓線蟲的特異性引物及其應用

在審

• 申請號: 201710061757.5
• 申請日: 2017-01-26
• 公開（公告）號: CN106591482A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 劉偉;劉雪松;譚磊;尹德明
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙)43213
• 代理人: 鄧宇

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，尤其涉及一種用于檢測豬復陰后圓線蟲的特異性引物及其應用。

背景技術

豬后圓線蟲為圓形目、后圓科、后圓屬，是豬復陰后圓線蟲、長刺后圓線蟲、薩姆氏后圓線蟲3種后圓線蟲的總稱，豬后圓線蟲病是一種由線蟲寄生于豬支氣管和細支氣管的線蟲病，由于蟲體呈絲狀，寄生于肺臟，故又稱豬肺絲蟲病或肺線蟲病。

豬后圓線蟲對羊、牛、豬均易感，偶見于羊、鹿、牛和其他反芻獸，亦偶見于人，主要發生在幼豬，死亡率較高，危害較大。豬肺絲蟲病呈地方性流行，在河谷區和低熱區多發。在我國，江西省豬后圓線蟲病感染率為40％，遼寧省為59.81％，湖南省為5.93％，河北省為18.5％，江蘇省為43.6％，四川省為20.7，并呈明顯的逐年上升趨勢。

對豬后圓線蟲病的準確診斷是有效防控此病的前提，現有的檢測方法主要根據臨床癥狀、流行病學情況、病理變化、進行初步診斷，并進一步結合糞便檢查蟲卵進行確診，雖然現有檢測方法簡單易行，對成蟲有一定的準確性，但對于形態上難以區分種類。特別是各種線蟲在蟲卵和幼蟲階段難以區分，而且豬復陰后圓線蟲、豬長刺后圓線蟲、豬薩姆氏后圓線蟲3種后圓線蟲彼此也難以區分，同時現有的檢測方法檢測效率、檢測準確性較低、檢測結果受檢測人員經驗影響大。

因此，有必要對現有豬復陰后圓線蟲檢測做進一步開發，提供一種檢測方法檢測效率高、檢測準確性高、檢測結果受檢測人員經驗影響小的檢測試劑盒及其使用方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，克服以上背景技術中提到的不足和缺陷，提供一種用于檢測豬復陰后圓線蟲的特異性引物及其應用，其具有檢測結果準確、檢測效率高的優點。

為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為：

本發明提供一種可用于檢測豬復陰后圓線蟲的特異性引物，所述特異性引物包括上游引物MpJB3F和下游引物MpJB4.5R，

MpJB3F的核苷酸序列為5'-ACTCGCATATATTTGTATAATATATG-3'；

MpJB4.5R的核苷酸序列為5'-TTTCATTCATCGACGCAAAATTCAT-3'。

通過比對多種豬后圓線蟲cox1基因，針對較穩定保守區設計所述MpJB3F和MpJB4.5R，預期擴增片段大小約為500bp左右。引物序列中G+C含量為40％～60％，上下游引物不存在二級結構，互配可能性低，引物具有特異性。

本發明還提供一種可用于檢測豬復陰后圓線蟲的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應液、以及引物混合液，所述引物混合液包括上述的特異性引物。

上述豬復陰后圓線蟲的檢測試劑盒，還包括陽性對照液，所述陽性對照液包括豬復陰后圓線蟲DNA。

上述豬復陰后圓線蟲的檢測試劑盒，所述DNA裂解液主要由100mM NaCl 70μl、pH值為8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值為8.0的25mM EDTA 150μl、1％W/V十二烷基硫酸鈉30μl和1.7μg/μL蛋白酶K 200μl組成。所述DNA裂解液采用適宜的比例配置，避免資源浪費。

上述的檢測試劑盒，所述PCR反應液包括PCR緩沖液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液。

上述的檢測試劑盒，所述引物混合液中所述MpJB3F和MpJB4.5R的濃度均為100pmol/μL。

本發明還提供一種如上述的特異性引物在檢測豬復陰后圓線蟲的應用。

上述的應用，利用所述特異性引物制成檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應液、以及引物混合液，所述引物混合液包括所述特異性引物，所述檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)DNA的提?。喝〈郎y蟲體樣品用雙蒸水反復吹打沖洗，移去雙蒸水，加入DNA裂解液置于37～55℃溫箱中16-18h，再提取DNA，制備得到樣品DNA；

(2)PCR擴增：取滅菌ddH₂O、PCR反應液、Taq酶和引物混合液按適合的PCR反應體系加入離心管中，混勻后分裝放入多個離心管中制得多份分裝液，取步驟(1)制備的樣品DNA，每一樣品DNA對應加入一份分裝液中并標號，混勻，置于PCR擴增儀上按適合的PCR擴增條件反應，制得PCR擴增產物；