[發明專利]用于檢測豬復陰后圓線蟲的特異性引物及其應用

在審

• 申請號: 201710061757.5
• 申請日: 2017-01-26
• 公開（公告）號: CN106591482A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 劉偉;劉雪松;譚磊;尹德明
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙)43213
• 代理人: 鄧宇

1.一種可用于檢測豬復陰后圓線蟲的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物包括上游引物MpJB3 F和下游引物MpJB4.5 R，

MpJB3 F的核苷酸序列為5'-ACTCGCATATATTTGTATAATATATG-3'；

MpJB4.5 R的核苷酸序列為5'-TTTCATTCATCGACGCAAAATTCAT-3'。

2.一種可用于檢測豬復陰后圓線蟲的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應液、以及引物混合液，所述引物混合液包括如權利要求1所述的特異性引物。

3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括陽性對照液，所述陽性對照液包括豬復陰后圓線蟲DNA。

4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA裂解液主要由100mM NaCl 70μl、pH值為8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值為8.0的25mM EDTA 150μl、1％W/V十二烷基硫酸鈉30μl和1.7μg/μL蛋白酶K 200μl組成。

5.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括PCR緩沖液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液。

6.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述引物混合液中所述MpJB3F和MpJB4.5R的濃度均為100pmol/μL。

7.一種如權利要求1所述的特異性引物在檢測豬復陰后圓線蟲的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，利用所述特異性引物制成檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應液、以及引物混合液，所述引物混合液包括所述特異性引物，所述檢測試劑盒的使用方法包括以下步驟：

(1)DNA的提取：取待測蟲體樣品用雙蒸水反復吹打沖洗，移去雙蒸水，加入DNA裂解液置于37～55℃溫箱中16-18h，再提取DNA，制備得到樣品DNA；

(2)PCR擴增：取滅菌ddH₂O、PCR反應液、Taq酶和引物混合液按適合的PCR反應體系加入離心管中，混勻后分裝放入多個離心管中制得多份分裝液，取步驟(1)制備的樣品DNA，每一樣品DNA對應加入一份分裝液中并標號，混勻，置于PCR擴增儀上按適合的PCR擴增條件反應，制得PCR擴增產物；

(3)PCR產物觀察：取步驟(2)制備的PCR擴增產物依標號加樣于1.0％瓊脂糖凝膠上，120～130V電壓電泳20～40分鐘后，置于紫外透射儀下觀察是否出現條帶，若存在500bp～520bp大小的條帶，則待測蟲體樣品為豬復陰后圓線蟲；若不存在500bp～520bp大小的條帶，則待檢測蟲體樣品不是豬復陰后圓線蟲。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述步驟(2)中PCR反應體系為緩沖液2～3μL、25mM的MgCl₂溶液3～4μL、2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液2μL、5U/μL的Taq酶0.25～0.3μL、樣品DNA、引物混合液0.8～1.2μL，余量為ddH₂O補至25μL。

10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec、52～58℃退火30sec、72℃延伸30sec，共38個循環；72℃延伸5min。