[發明專利]鐮刀菌病病原菌RT-PCR檢測引物和探針組合及試劑盒

有效

• 申請號: 201710061639.4
• 申請日: 2017-01-26
• 公開（公告）號: CN106868114B
• 公開（公告）日: 2020-01-07
• 發明（設計）人: 龔杰;張雯;吳偉偉;陳見友;陸捷潔;韓娜;張婷婷;黎青山
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 11002 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王文君

本發明提供一種鐮刀菌病病原菌實時熒光定量PCR檢測引物和探針組合及試劑盒。所述引物和探針組合的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1?12所示。本發明的試劑盒能夠快速、特異、靈敏、穩定對角膜鐮刀菌病病原菌進行分子診斷。在建立了可靠的鐮刀菌病病原菌檢測體系的基礎上，本發明針對性地設計了競爭性內參，確保陰性結果的真實可信。同時，本發明提供的試劑盒包含改良的DNA提取體系，能快速有效地完成DNA提取過程，使檢測更為快捷方便。

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域，具體地說，涉及鐮刀菌病病原菌實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測引物和探針組合及試劑盒。

背景技術

真菌性角膜炎是一種世界范圍內常見的致盲性眼病，多見于包括中國在內的農業人口為主的發展中國家。其中，又以鐮刀菌屬真菌引起的角膜鐮刀菌病最為常見。統計資料表明，同仁醫院眼科研究所報告的775例真菌性角膜炎中，角膜鐮刀菌占58.7％，其病原菌以茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌和尖孢鐮刀菌為主。

近年來，隨著廣譜抗生素、皮質激素、免疫抑制劑和抗腫瘤藥物的廣泛應用，角膜鐮刀菌病的發病率有較明顯的上升趨勢。角膜鐮刀菌病起病緩慢，外用抗生素無效，早期主要癥狀包括疼痛、畏光、紅腫、視力模糊，如治療不及時，可以引起角膜穿孔，導致失明。因此，真菌性角膜炎的早期診斷對防盲、治盲意義重大，只有早期及時確診，才能合理治療。

目前，臨床上常用的診斷方法包括鏡檢、培養、共聚焦顯微鏡檢查、組織病理檢查等。但除培養外，都不能達到真菌鑒定到種水平。而真菌培養，耗時過長，一般需1-2周，不適用于臨床早期診斷。因此，開發精準的分子診斷技術，用于對角膜鐮刀菌病的診療，有著非常重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種鐮刀菌病病原菌實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測引物和探針組合及試劑盒。

本發明的另一目的是提供一種用于非疾病診斷目的檢測鐮刀菌病病菌的方法。

本發明的再一目的是提供一種改良的真菌DNA提取液。

為了實現本發明目的，本發明的鐮刀菌病病原菌實時熒光定量PCR檢測引物和探針組合，該組合包括：

(I)用于檢測鐮刀菌的通用引物和探針，所述鐮刀菌包括茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌和尖孢鐮刀菌(SEQ ID NO:1-3)

Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′

Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′

Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′

(II)用于檢測串珠鐮刀菌的特異性引物和探針(SEQ ID NO:4-6)

Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′

Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′

Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；

其中，[T]表示鎖核酸；

(III)用于檢測茄病鐮刀菌的特異性引物和探針(SEQ ID NO:7-9)

Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′

Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′

Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及