[發明專利]在植物細胞內表達外源基因的核酸構建物及其應用

有效

• 申請號: 201710061566.9
• 申請日: 2017-01-26
• 公開（公告）號: CN108018306B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 朱健康;王木桂;陸鈺明;毛妍斐
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

本發明提供了一種在植物細胞內復制或表達外源基因的核酸構建物及其應用。具體地，本發明提供了一種具有特定結構的核酸構建物，以及利用該構建物提高外源基因在植物基因組進行同源重組或定點敲入效率的方法。本發明的方法可以有效篩選同源重組或定點插入事件，從而實現外源基因片段在植物基因組的高效重組或定點插入，可以廣泛應用于植物基因功能研究和作物遺傳改良。本發明還提供了包含該外源構建物的載體，植物細胞和植物。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種在植物細胞內表達外源基因的核酸構建物及其應用。

背景技術

在植物細胞內進行基因同源重組或定向插入一直是一個難題，為突破這個瓶頸前人已經做了大量嘗試，如在2002年，Terada等人提出了基于農桿菌介導的同源重組技術(Terada et al.,2002)，這套技術體系不依賴于所改造基因的功能進行篩選，理論上可以應用于所有基因序列的打靶。然而，要保證該技術應用的成功，需要有高效的農桿菌轉化效率及大規模的轉化量，更重要的是，還需要附加一套復雜的正負篩選系統以消除在農桿菌轉化中產生的大量隨機插入事件。盡管Terada等人連續成功地把該技術應用在水稻基因定向替換實驗中(Terada et al.,2002；Terada et al.,2007)，但由于極低的整合效率一直無法得以提高，加上正負篩選系統構造復雜，該技術體系并沒有得到推廣應用。

近年來，隨著基因定向編輯工具如鋅指蛋白核糖核酸酶(Zinc finger nulease，ZFN)、轉錄激活樣效應因子核酸酶(Transcription activator-like effectors nulease，TALEN)和規律成簇間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)系統的推廣應用，特別是后兩者由于活性高，特異性好而且幾乎沒有序列的限制，近兩年來發展非常迅速，并且在大量物種上得到成功應用(Li etal.,2012；Sun et al.,2012；Zhang et al.,2012；Dang et al.,2013；Feng et al.,2013；Li et al.,2013；Shan et al.,2013)。上述三種基因定向編輯工具的作用機理有相通之處，通過識別序列把核酸剪切酶引導至需要編輯的基因位點上，隨后的剪切作用造成DNA序列的雙鏈斷裂(double strands break，DSB)，激活了宿主細胞的DNA修復途徑，通過非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)的方式，或者當同源模板在附近時，通過同源重組(homologous recombination，HR)的方式修復雙鏈缺口。因此，利用基因定向編輯工具酶在靶位點附近制造一個DSB能在轉化中極大地增加基因同源重組或定向插入的機率。

然而，相對于動物細胞和人類細胞，由于有細胞壁的阻礙，在植物細胞內進行基因重組或外源片段定點插入的一個巨大挑戰就是如何把足夠大量的供體分子輸送到細胞中去。當然，對一些植物品種來說，例如蔬菜及一些觀賞性植物，它們可以通過原生質體再生的方式重建植株(Davey et al.,2005)，這樣，就可以利用原生質體作為受體，通過電轉化或PEG介導的方式實現對大量細胞的轉化，從而有足夠的轉化體對所期待的突變位點進行篩選(Zhang et al.,2012)。通過TALEN或CRISPR介導的基因打靶也已經在水稻、擬南芥、煙草等植物上得到成功(Zhang et al.,2012；Feng et al.,2013；Shan et al.,2013)，當然，這些基因打靶事件都是原生質體水平上實現的。但是對于水稻、擬南芥等植物品種，通過原生質體重建植株在目前來說幾乎是不可能的，只能開發其它技術去攻克這一難關。