[發明專利]在植物細胞內表達外源基因的核酸構建物及其應用

有效

• 申請號: 201710061566.9
• 申請日: 2017-01-26
• 公開（公告）號: CN108018306B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 朱健康;王木桂;陸鈺明;毛妍斐
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

1.一種核酸構建物，其特征在于，所述的構建物具有從5’至3’的式I結構：

A-B-C-D-E-F-G-H (I)

式中，

A、B、C、D、E、F、G、H分別為用于構成所述構建物的元件；

各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列；

A為第一長基因間隔區序列；

B為5’同源臂序列；

C為外源基因表達盒；

D為3’同源臂序列；

E為第二表達盒；

F為短基因間隔區序列；

G為玉米線條病毒屬病毒的復制蛋白的編碼序列；

H為第二長基因間隔區序列；

并且，所述第一長基因間隔區序列、短基因間隔區序列、和第二長基因間隔區序列來源于玉米線條病毒屬(Mastrevirus)病毒；

并且，所述的外源基因表達盒具有從5’至3’的式III結構：

Ci-Cii-Ciii-Civ (III)

式中，

Ci、Cii、Ciii、Civ分別為用于構成所述外源基因表達盒的元件；

各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列；

Ci為第一外源蛋白的編碼序列；

Cii為2A序列或IRES序列；

Ciii為第二外源蛋白的編碼序列；

Civ為終止子序列；

其中，所述元件Ci中的第一外源蛋白編碼序列不包含起始密碼子和終止密碼子，所述元件Ciii中的第二外源蛋白的編碼序列不包含起始密碼子；

其中，所述元件A為改造后的第一長基因間隔區序列，所述元件A不具有轉錄驅動能力；

其中，所述的第二表達盒為定點切割核酸酶的靶向位點識別序列的表達盒。

2.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的玉米線條病毒屬病毒包括小麥矮縮病毒(WDV)、菜豆黃矮病毒(BeYDV)、玉米線條病毒（MSV）、煙草黃矮病毒（TYDV）。

3.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的第一外源蛋白包括：β-葡萄糖苷酸酶、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白。

4.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的第二外源蛋白的編碼序列為篩選標記，所述篩選標記包括潮霉素抗性基因(Hyg)、卡那霉素抗性基因(NptII)、GFP基因、Amp抗性基因、草丁膦抗性基因(Bar)。

5.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的元件Cii具有自我剪切功能。

6.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述元件A的序列如SEQ ID NO: 1的第1-329位所示。

7.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的定點切割核酸酶包括鋅指蛋白核糖核酸酶(ZFN)、轉錄激活樣效應因子核酸酶(TALEN)、規律成簇間隔短回文重復序列關聯蛋白(Cas)和Cpf1。

8.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的識別序列表達盒為sgRNA表達盒。

9.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的元件A和元件H之間可以形成環狀復制子。

10.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的元件B和元件D為所述定點切割核酸酶的靶向位點兩側的同源臂序列。

11.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的元件G包括復制蛋白序列Rep和復制蛋白序列RepA。

12.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求1所述的構建物。

13.如權利要求12所述的載體，其特征在于，所述的載體為植物表達載體。