[發(fā)明專利]用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106868113A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬康林;紀(jì)凌云;蔣毅;劉海燦;李馬超
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，目前全球有超過1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，每年有200萬人因結(jié)核病死亡。結(jié)核分枝桿菌除感染人外，還感染50多種哺乳動物和20多種禽類；在家畜中，牛最易感染牛型結(jié)核分枝桿菌而發(fā)生結(jié)核病，特別是奶牛，其次是水牛和黃牛，不但影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展，造成經(jīng)濟(jì)損失，而使人畜健康受到嚴(yán)重威脅。結(jié)核病是全球重要的公共衛(wèi)生問題，在一些發(fā)達(dá)國家如德國、澳大利亞等國的人結(jié)核病患者中，約0.2％～0.3％是由牛型結(jié)核分枝桿菌引起的，而在埃塞俄比亞、尼日利亞、坦桑尼亞等不發(fā)達(dá)國家中，這個(gè)比例高達(dá)17.0％一26.1％。由此可見，控制牛結(jié)核病不僅對于動物疫病防治，還是對人健康，都具有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

結(jié)核病的早期診斷對結(jié)核病的控制至關(guān)重要，而結(jié)核病防治的最大挑戰(zhàn)之一就是缺乏早期、快速、敏感和特異的診斷工具。目前分枝桿菌菌種的鑒定，傳統(tǒng)的分類、鑒定系統(tǒng)主要以形態(tài)和生理生化特征的綜合指標(biāo)為依據(jù)，易受多種因素影響，鑒定結(jié)果極不可靠，存在著很大的異質(zhì)性，鑒定一種菌種耗時(shí)長約4周，還不包括培養(yǎng)所需時(shí)間4-8周，因此有較大局限性。如PNB、TCH鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行菌種鑒定，雖然已被常規(guī)應(yīng)用，但其為臨床提供信息緩慢，而且鑒定出的菌種有一定局限性，只能區(qū)分出結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌，不能進(jìn)一步進(jìn)行種的鑒定。

目前，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定分枝桿菌菌種不僅快速可靠，而且具有成本低廉，可建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序的優(yōu)點(diǎn)，成為快速鑒定分枝桿菌的新方法?；谂Ｐ头种U菌PstS基因的特異性突變位點(diǎn)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，高效、靈敏、特異度高，用于檢測牛型結(jié)核分枝桿菌，可以將牛型結(jié)核分枝桿菌與其它分枝桿菌區(qū)分開。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標(biāo)記，所述SNP標(biāo)記位于牛型結(jié)核分枝桿菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，該序列第53位堿基C為SNP突變位點(diǎn)。利用該特異性突變位點(diǎn)將牛型分枝桿菌從分枝桿菌中分離出來。

本發(fā)明所述牛型結(jié)核分枝桿菌PstS基因的部分核苷酸序列如SEQID No:2所示。

本發(fā)明還提供用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測所述SNP標(biāo)記的引物及探針，上游引物：5'-TTTCTGCACTGGGCGATCA-3'，下游引物：5'-CAACGCGTCAGACAACTTCAC-3'。探針：5'-FAM-ACCAGGCTCATTTC-MGB-3'。

本發(fā)明還提供含有所述引物及探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

本發(fā)明還提供所述引物及探針或所述試劑盒在鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用。

包括以下步驟：

1)提取待測樣品的DNA；

2)以上述提取的DNA為模板，利用所述引物及探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；

3)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

其中，步驟2)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，上、下游引物及探針的終濃度為250nmol/L，DNA模板2μl，去離子水加至總量為20μl。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，59.3℃退火60s，共40個(gè)循環(huán)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的儀器為BIO RAD MJ MiniOpticon。

步驟3)根據(jù)是否出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，分析是否含有牛型結(jié)核分枝桿菌；含有牛型結(jié)核分枝桿菌的待測樣品會出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表現(xiàn)為陽性結(jié)果；不含有牛型結(jié)核分枝桿菌的待測樣品不出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表現(xiàn)為陰性結(jié)果。