[發明專利]細胞色素P450突變蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201710057245.1
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108330111B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 周志華;王平平;嚴興;孫鳳嬌;程宜興;楊成帥
• 申請（專利權）人: 生合萬物（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12N15/82;C12P33/00;C12N15/113
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;馬思敏

1.一種細胞色素P450的突變蛋白，其特征在于，所述的突變蛋白為非天然蛋白，且所述突變蛋白具有催化生成原人參二醇的催化活性，并且所述突變蛋白在野生型的細胞色素P450的對應于SEQ ID NO.1的選自下組的與酶催化活性相關的核心氨基酸發生突變：

第91位脯氨酸P，并且第91位脯氨酸P突變為組氨酸H；或

所述的突變蛋白缺失SEQ ID NO. 1中1-4位，且第18位亮氨酸L突變為異亮氨酸I，所述細胞色素P450的突變蛋白催化達瑪烯二醇DM反應生成原人參二醇PPD。

2.如權利要求1所述的突變蛋白，其特征在于，所述的突變為P91H。

3.如權利要求1所述的突變蛋白，其特征在于，所述細胞色素P450的突變蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或8所示。

4.一種多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權利要求1所述的突變蛋白。

5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸選自下組：

(a)編碼如SEQ ID NO.6或8所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.19或21所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列與SEQ ID NO.19或21所示序列的同源性≥95%，且編碼SEQ ID NO.6、8任一所示多肽的多核苷酸。

6.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求4所述的多核苷酸。

7.一種工程化的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有權利要求6所述的載體，或其基因組中整合有權利要求4所述的多核苷酸。

8.一種產生權利要求1所述細胞色素P450的突變蛋白的方法，其特征在于，包括步驟：

在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞，從而表達出細胞色素P450的突變蛋白；和

分離所述細胞色素P450的突變蛋白。

9.一種酶制劑，其特征在于，所述酶制劑包含權利要求1所述的細胞色素P450的突變蛋白。

10.一種制備原人參二醇的方法，其特征在于，包括步驟：

(i)將權利要求1所述的細胞色素P450的突變蛋白與反應底物接觸，進行催化反應，從而獲得所述原人參二醇；和

(ii)任選地，分離并純化所述原人參二醇。

11.一種權利要求1所述的突變蛋白的用途，其特征在于，所述的突變蛋白用于催化達瑪烯二醇生成原人參二醇，或被用于制備催化達瑪烯二醇生成原人參二醇的催化制劑。

12.一種權利要求1所述的突變蛋白或權利要求7所述的宿主細胞的用途，其特征在于，用于制備原人參二醇。

13.一種產生轉基因植物的方法，其特征在于，包括步驟：將權利要求6所述的載體或權利要求4所述的核苷酸整合到宿主細胞中，再生為植物。

14.一種表達盒，其特征在于，所述的表達盒含有啟動子，以及與所述啟動子操作性相連的權利要求4所述的多核苷酸，所述的啟動子的序列為SEQ ID NO.10-13中任一所示的序列。