[發(fā)明專利]細胞色素P450突變蛋白及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710057245.1
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108330111B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周志華;王平平;嚴興;孫鳳嬌;程宜興;楊成帥
• 申請（專利權(quán)）人: 生合萬物（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12N15/82;C12P33/00;C12N15/113
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;馬思敏

本發(fā)明提供了一種細胞色素P450突變蛋白及其應用，具體地，本發(fā)明對細胞色素P450 CYP716A47中的關(guān)鍵位點進行改造后，可以顯著提高PPD產(chǎn)量以及PPD/DM比例。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物生物學、天然產(chǎn)物藥物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種細胞色素P450突變蛋白及其應用。

背景技術(shù)

人參皂苷是五加科人參屬植物(如人參、三七、西洋參等)中的主要活性物質(zhì)，近年來在葫蘆科植物絞股藍中也發(fā)現(xiàn)一些人參皂苷。目前，國內(nèi)外科學家已經(jīng)從人參、絞股藍等植物中分離出了至少100多種人參皂苷，這些皂苷在人參中的含量差別非常大。其中一些療效顯著的三萜皂苷在天然總皂苷中含量極低(亦被稱為稀有皂苷)，由于提取的成本很高，所以價格就非常昂貴。目前多種皂苷已經(jīng)用于臨床，如以人參皂苷Rg3單體為主要成分的藥物參一膠囊可改善腫瘤患者的氣虛癥狀，提高機體免疫功能。以人參皂苷Rh2單體為主要成分的今幸膠囊是一種保健藥品用于提高機體免疫力，增強抗病能力。

由于稀有人參皂苷往往具有獨特生物活性或更顯著療效，傳統(tǒng)制備稀有人參皂苷都是從人參或三七中提取的大量皂苷經(jīng)過化學水解法、酶法水解和微生物法水解來制備。由于野生的人參資源已基本耗竭，人參總皂苷資源目前主要來源于人參或三七的人工栽培，而其人工栽培的生長周期長(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，還經(jīng)常受到病蟲害而需要施用大量的農(nóng)藥，所以，人參或三七的人工栽培有嚴重的連作障礙(人參或三七種植地需要休耕5-15年以上才能克服連作障礙)，所以人參皂苷的產(chǎn)量、品質(zhì)及安全性都面臨挑戰(zhàn)。另一方面，以人參總皂苷為原料來制備單一成分的皂苷，因為總皂苷中還有大量的成份無法轉(zhuǎn)化為目標人參皂苷單體(例如原人參三醇型皂苷)無法得到利用，不僅造成資源的浪費，還會增加抽提純化成本。

合成生物學的發(fā)展為植物來源的天然產(chǎn)物的異源合成提供了新的機遇。以酵母為底盤，通過代謝途徑的組裝和優(yōu)化，已經(jīng)實現(xiàn)了用廉價的單糖來發(fā)酵合成青蒿酸或者雙氫青蒿酸，繼而再通過一步化學轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)青蒿素，這表明合成生物學在天然產(chǎn)物的藥物合成方面具有的巨大潛力。利用酵母底盤細胞通過合成生物學方法異源合成稀有人參皂苷單體，原料為廉價的單糖，制備過程為安全性可調(diào)控的發(fā)酵過程，避免了任何外來污染(例如，原料植物人工種植時使用的農(nóng)藥)，因此，通過合成生物學技術(shù)制備稀有人參皂苷單體，不僅具有成本優(yōu)勢，而且，可以保證成品的品質(zhì)與安全性。利用合成生物學技術(shù)制備足夠量的各種高純度稀有人參皂苷單體，用于活性測定及臨床實驗，促進稀有人參皂苷的創(chuàng)新藥物研發(fā)。

利用合成生物學方法來人工合成具有藥用活性的人參皂苷，首要需要解析與重構(gòu)原人參二醇PPD的合成代謝途徑。由于人參皂苷屬于三萜化合物，植物中MVA和MEP代謝途徑提供了萜類化合物的共同前體IPP和DMAPP，為三萜化合物前體角鯊烯和2,3-環(huán)氧角鯊烯的合成奠定了基礎(chǔ)由于目前的細胞色素P450 蛋白催化達瑪烯二醇合成原人參二醇催化活性很低，在利用微生物細胞工廠生產(chǎn)PPD時是一個限速步驟，不僅限制了PPD產(chǎn)量的提高也導致了中間產(chǎn)物DM的積累。

因此，本領(lǐng)域需要對細胞色素P450進行更多的研究和改造，以獲得更高效的細胞色素P450蛋白元件從而促進人參皂苷細胞工廠合成效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種細胞色素P450突變蛋白，通過采用所述的突變蛋白可以產(chǎn)生很高的PPD產(chǎn)量以及PPD/DM比例。

本發(fā)明的第一方面提供了一種細胞色素P450的突變蛋白，所述的突變蛋白為非天然蛋白，且所述突變蛋白具有催化生成原人參二醇的催化活性，并且所述突變蛋白在野生型的細胞色素P450的對應于SEQ ID NO.:1的選自下組的一個或多個與酶催化活性相關(guān)的核心氨基酸發(fā)生突變：

第91位脯氨酸(P)；

第87位亮氨酸(L)；

第235位賴氨酸(K)；

第349位賴氨酸(K)；

第366位纈氨酸(V)；