[發(fā)明專(zhuān)利]一種燕麥花葉病毒的RT?PCR檢測(cè)方法、引物和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710056939.3
• 申請(qǐng)日: 2017-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058616A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張衛(wèi)東;黃永輝;權(quán)永兵;廖力;徐淼鋒;遲遠(yuǎn)麗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44205
• 代理人: 李先林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物物種分子診斷領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)方法、引物和試劑盒。

背景技術(shù)

燕麥花葉病毒(Oat mosaic virus，OMV)為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)，大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)，為線狀，常彎曲，無(wú)包膜，具有明顯的形態(tài)長(zhǎng)度，長(zhǎng)約600～750nm，寬12～14nm。OMV主要侵染燕麥屬植物，引起秋季播種的燕麥發(fā)病，可以引起39～60％的減產(chǎn)。OMV的傳播主要依賴(lài)禾谷多粘菌以持久性方式傳播，長(zhǎng)距離擴(kuò)散則隨感病植株的無(wú)性繁殖材料傳播。目前，OMV主要分布于美國(guó)、加拿大、新西蘭、英國(guó)、法國(guó)、愛(ài)爾蘭等國(guó)，在我國(guó)尚未見(jiàn)發(fā)生，2007年農(nóng)業(yè)部862號(hào)公文《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》將其列為重要的對(duì)外檢疫性有害生物。因此，建立該病毒的快速檢疫鑒定技術(shù)及相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

半個(gè)世紀(jì)來(lái)，現(xiàn)代病毒學(xué)研究水平不斷提高，病毒的檢測(cè)技術(shù)也在不斷發(fā)展和改進(jìn)。目前病毒的檢測(cè)方法主要包括枯斑和指示植物檢測(cè)法，酶標(biāo)免疫吸附法(ELISA)，電鏡負(fù)染檢測(cè)法，免疫電鏡檢測(cè)法，電鏡超薄切片法以及PCR檢測(cè)方法。血清學(xué)方法是目前普遍運(yùn)用的常規(guī)檢測(cè)方法，可操作性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)可靠。但是該方法依賴(lài)于高質(zhì)量的抗血清，成本較高，周期性長(zhǎng)，且靈敏度有限，難以檢測(cè)含量很少的病毒。同時(shí)，燕麥花葉病毒所在的大麥黃花葉病毒屬各個(gè)成員在血清學(xué)上密切相關(guān)，因而難以采用ELISA方法來(lái)準(zhǔn)確檢測(cè)燕麥花葉病毒。

PCR技術(shù)也是目前國(guó)內(nèi)外植物病毒檢測(cè)中應(yīng)用較成功的方法。專(zhuān)利CN 102102133 A“棉花曲葉病毒檢測(cè)用引物”公開(kāi)了棉花曲葉病毒定性PCR檢測(cè)方法。但是，迄今為止，缺乏一種針對(duì)燕麥花葉病毒的特異性強(qiáng)、靈敏度高的RT-PCR檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對(duì)OMV的外殼蛋白基因(CP gene)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性檢測(cè)燕麥花葉病毒的引物，并優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，建立了RT-PCR快速檢測(cè)OMV病毒的方法。該方法具有很強(qiáng)的特異性，可以從大麥黃花葉病毒屬中特異性檢出OMV病毒。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速高效，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，非常適合在檢驗(yàn)檢疫口岸的推廣應(yīng)用。

為此，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種用于燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)的引物，包括上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2，其序列分別如下：

OMV-F2：5′-CCTCGGATGGTGCGTCAATA-3′；(SEQ ID No.1)

OMV-R2：5′-AACCCTGTGGTGGGTTGTTT-3′。(SEQ ID No.2)

一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)方法，包括使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。

進(jìn)一步地，該檢測(cè)方法包括以下步驟：

S1、取待測(cè)樣品提取植物組織總RNA；

S2、以總RNA為模板，引入下游引物OMV-R2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成；

S3、將上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2置于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

S4、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，鑒定樣品中是否含有燕麥花葉病毒。

進(jìn)一步地，所述步驟S2中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成時(shí)，其反應(yīng)體系為：

反應(yīng)條件為：37℃保溫60min，70℃15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

進(jìn)一步地，所述dNTP的濃度為10mmol/L，所述下游引物OMV-R2的濃度為10μmol/L。

進(jìn)一步地，所述步驟S3中PCR反應(yīng)體系為：

反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃1min，60℃50s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

進(jìn)一步地，所述上游引物OMV-F2和下游引物OMV-R2的濃度均為10μmol/L。

一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包含以上所述的引物。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明針對(duì)檢疫性有害生物燕麥花葉病毒，設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了RT-PCR快速檢測(cè)OMV的方法，具有檢測(cè)快速簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間也縮減到2小時(shí)之內(nèi)，極大的提高了效率，適用于我國(guó)各大檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)針對(duì)檢疫性有害生物燕麥花葉病毒的鑒定。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例RT-PCR檢測(cè)OMV的特異性結(jié)果；