[發(fā)明專(zhuān)利]一種燕麥花葉病毒的RT?PCR檢測(cè)方法、引物和試劑盒在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201710056939.3 | 申請(qǐng)日: | 2017-01-19 |
| 公開(kāi)(公告)號(hào): | CN107058616A | 公開(kāi)(公告)日: | 2017-08-18 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 張衛(wèi)東;黃永輝;權(quán)永兵;廖力;徐淼鋒;遲遠(yuǎn)麗 | 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人: | 珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 |
| 主分類(lèi)號(hào): | C12Q1/70 | 分類(lèi)號(hào): | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94 |
| 代理公司: | 廣州嘉權(quán)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44205 | 代理人: | 李先林 |
| 地址: | 519015 廣東省*** | 國(guó)省代碼: | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書(shū): | 查看更多 | 說(shuō)明書(shū): | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 燕麥 花葉 病毒 rt pcr 檢測(cè) 方法 引物 試劑盒 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物物種分子診斷領(lǐng)域,具體地說(shuō),涉及一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)方法、引物和試劑盒。
背景技術(shù)
燕麥花葉病毒(Oat mosaic virus,OMV)為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae),大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus),為線狀,常彎曲,無(wú)包膜,具有明顯的形態(tài)長(zhǎng)度,長(zhǎng)約600~750nm,寬12~14nm。OMV主要侵染燕麥屬植物,引起秋季播種的燕麥發(fā)病,可以引起39~60%的減產(chǎn)。OMV的傳播主要依賴(lài)禾谷多粘菌以持久性方式傳播,長(zhǎng)距離擴(kuò)散則隨感病植株的無(wú)性繁殖材料傳播。目前,OMV主要分布于美國(guó)、加拿大、新西蘭、英國(guó)、法國(guó)、愛(ài)爾蘭等國(guó),在我國(guó)尚未見(jiàn)發(fā)生,2007年農(nóng)業(yè)部862號(hào)公文《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》將其列為重要的對(duì)外檢疫性有害生物。因此,建立該病毒的快速檢疫鑒定技術(shù)及相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。
半個(gè)世紀(jì)來(lái),現(xiàn)代病毒學(xué)研究水平不斷提高,病毒的檢測(cè)技術(shù)也在不斷發(fā)展和改進(jìn)。目前病毒的檢測(cè)方法主要包括枯斑和指示植物檢測(cè)法,酶標(biāo)免疫吸附法(ELISA),電鏡負(fù)染檢測(cè)法,免疫電鏡檢測(cè)法,電鏡超薄切片法以及PCR檢測(cè)方法。血清學(xué)方法是目前普遍運(yùn)用的常規(guī)檢測(cè)方法,可操作性強(qiáng),檢測(cè)結(jié)果相對(duì)可靠。但是該方法依賴(lài)于高質(zhì)量的抗血清,成本較高,周期性長(zhǎng),且靈敏度有限,難以檢測(cè)含量很少的病毒。同時(shí),燕麥花葉病毒所在的大麥黃花葉病毒屬各個(gè)成員在血清學(xué)上密切相關(guān),因而難以采用ELISA方法來(lái)準(zhǔn)確檢測(cè)燕麥花葉病毒。
PCR技術(shù)也是目前國(guó)內(nèi)外植物病毒檢測(cè)中應(yīng)用較成功的方法。專(zhuān)利CN 102102133 A“棉花曲葉病毒檢測(cè)用引物”公開(kāi)了棉花曲葉病毒定性PCR檢測(cè)方法。但是,迄今為止,缺乏一種針對(duì)燕麥花葉病毒的特異性強(qiáng)、靈敏度高的RT-PCR檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,針對(duì)OMV的外殼蛋白基因(CP gene)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性檢測(cè)燕麥花葉病毒的引物,并優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,建立了RT-PCR快速檢測(cè)OMV病毒的方法。該方法具有很強(qiáng)的特異性,可以從大麥黃花葉病毒屬中特異性檢出OMV病毒。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速高效,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,非常適合在檢驗(yàn)檢疫口岸的推廣應(yīng)用。
為此,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種用于燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)的引物,包括上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2,其序列分別如下:
OMV-F2:5′-CCTCGGATGGTGCGTCAATA-3′;(SEQ ID No.1)
OMV-R2:5′-AACCCTGTGGTGGGTTGTTT-3′。(SEQ ID No.2)
一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)方法,包括使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
進(jìn)一步地,該檢測(cè)方法包括以下步驟:
S1、取待測(cè)樣品提取植物組織總RNA;
S2、以總RNA為模板,引入下游引物OMV-R2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成;
S3、將上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2置于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng);
S4、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,鑒定樣品中是否含有燕麥花葉病毒。
進(jìn)一步地,所述步驟S2中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成時(shí),其反應(yīng)體系為:
反應(yīng)條件為:37℃保溫60min,70℃15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。
進(jìn)一步地,所述dNTP的濃度為10mmol/L,所述下游引物OMV-R2的濃度為10μmol/L。
進(jìn)一步地,所述步驟S3中PCR反應(yīng)體系為:
反應(yīng)條件為:95℃5min;95℃1min,60℃50s,72℃60s,35個(gè)循環(huán);72℃10min。
進(jìn)一步地,所述上游引物OMV-F2和下游引物OMV-R2的濃度均為10μmol/L。
一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)試劑盒,包含以上所述的引物。
本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明針對(duì)檢疫性有害生物燕麥花葉病毒,設(shè)計(jì)了特異性引物,建立了RT-PCR快速檢測(cè)OMV的方法,具有檢測(cè)快速簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),檢測(cè)時(shí)間也縮減到2小時(shí)之內(nèi),極大的提高了效率,適用于我國(guó)各大檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)針對(duì)檢疫性有害生物燕麥花葉病毒的鑒定。
附圖說(shuō)明
圖1是實(shí)施例RT-PCR檢測(cè)OMV的特異性結(jié)果;
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