[發明專利]一種燕麥花葉病毒的RT?PCR檢測方法、引物和試劑盒

在審

• 申請號: 201710056939.3
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN107058616A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 張衛東;黃永輝;權永兵;廖力;徐淼鋒;遲遠麗
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 李先林

技術領域

本發明涉及生物物種分子診斷領域，具體地說，涉及一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測方法、引物和試劑盒。

背景技術

燕麥花葉病毒(Oat mosaic virus，OMV)為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)，大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)，為線狀，常彎曲，無包膜，具有明顯的形態長度，長約600～750nm，寬12～14nm。OMV主要侵染燕麥屬植物，引起秋季播種的燕麥發病，可以引起39～60％的減產。OMV的傳播主要依賴禾谷多粘菌以持久性方式傳播，長距離擴散則隨感病植株的無性繁殖材料傳播。目前，OMV主要分布于美國、加拿大、新西蘭、英國、法國、愛爾蘭等國，在我國尚未見發生，2007年農業部862號公文《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》將其列為重要的對外檢疫性有害生物。因此，建立該病毒的快速檢疫鑒定技術及相關檢測標準具有非常重要的經濟價值和社會價值。

半個世紀來，現代病毒學研究水平不斷提高，病毒的檢測技術也在不斷發展和改進。目前病毒的檢測方法主要包括枯斑和指示植物檢測法，酶標免疫吸附法(ELISA)，電鏡負染檢測法，免疫電鏡檢測法，電鏡超薄切片法以及PCR檢測方法。血清學方法是目前普遍運用的常規檢測方法，可操作性強，檢測結果相對可靠。但是該方法依賴于高質量的抗血清，成本較高，周期性長，且靈敏度有限，難以檢測含量很少的病毒。同時，燕麥花葉病毒所在的大麥黃花葉病毒屬各個成員在血清學上密切相關，因而難以采用ELISA方法來準確檢測燕麥花葉病毒。

PCR技術也是目前國內外植物病毒檢測中應用較成功的方法。專利CN 102102133 A“棉花曲葉病毒檢測用引物”公開了棉花曲葉病毒定性PCR檢測方法。但是，迄今為止，缺乏一種針對燕麥花葉病毒的特異性強、靈敏度高的RT-PCR檢測方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，針對OMV的外殼蛋白基因(CP gene)設計一對特異性檢測燕麥花葉病毒的引物，并優化反應體系和反應程序，建立了RT-PCR快速檢測OMV病毒的方法。該方法具有很強的特異性，可以從大麥黃花葉病毒屬中特異性檢出OMV病毒。該方法靈敏度高、特異性強、快速高效，檢測結果準確可靠，非常適合在檢驗檢疫口岸的推廣應用。

為此，本發明所采用的技術方案是：

一種用于燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測的引物，包括上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2，其序列分別如下：

OMV-F2：5′-CCTCGGATGGTGCGTCAATA-3′；(SEQ ID No.1)

OMV-R2：5′-AACCCTGTGGTGGGTTGTTT-3′。(SEQ ID No.2)

一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測方法，包括使用上述引物進行PCR擴增的步驟。

進一步地，該檢測方法包括以下步驟：

S1、取待測樣品提取植物組織總RNA；

S2、以總RNA為模板，引入下游引物OMV-R2進行反轉錄模板cDNA的合成；

S3、將上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2置于PCR儀中進行PCR擴增反應；

S4、對擴增產物進行電泳分離，鑒定樣品中是否含有燕麥花葉病毒。

進一步地，所述步驟S2中進行反轉錄模板cDNA的合成時，其反應體系為：

反應條件為：37℃保溫60min，70℃15min滅活反轉錄酶。

進一步地，所述dNTP的濃度為10mmol/L，所述下游引物OMV-R2的濃度為10μmol/L。

進一步地，所述步驟S3中PCR反應體系為：

反應條件為：95℃5min；95℃1min，60℃50s，72℃60s，35個循環；72℃10min。

進一步地，所述上游引物OMV-F2和下游引物OMV-R2的濃度均為10μmol/L。

一種燕麥花葉病毒的RT-PCR檢測試劑盒，包含以上所述的引物。

本發明的有益效果是：本發明針對檢疫性有害生物燕麥花葉病毒，設計了特異性引物，建立了RT-PCR快速檢測OMV的方法，具有檢測快速簡單、特異性好、靈敏度高、穩定性強等優點，檢測時間也縮減到2小時之內，極大的提高了效率，適用于我國各大檢驗檢疫機構針對檢疫性有害生物燕麥花葉病毒的鑒定。

附圖說明

圖1是實施例RT-PCR檢測OMV的特異性結果；