[發明專利]一種sgRNA及其構建的慢病毒載體和應用

在審

• 申請號: 201710054835.9
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106801056A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 姚永超;陳小平;余松林;肖宏奎;李姣姣;秦莉;趙思婷
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;C12N7/01;A61K48/00;A61P31/18
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司11332
• 代理人: 鞏克棟,侯桂麗

技術領域

本發明涉及基因治療領域，尤其涉及一種sgRNA及其構建的慢病毒載體和應用，具體為以SIVmac_1A11慢病毒為骨架，表達SpCas9蛋白及基因特異性的sgRNA，用于治療人和猴艾滋病。

背景技術

成簇的規律間隔短回文重復序列及其相關的Cas9蛋白系統(CRISPR/Cas9)是細菌和古細菌用于抵御外源病毒感染的天然防御機制。外源的DNA入侵細菌/古細菌后，會被細胞中與外源DNA特定區域互補的RNA引導序列(guideRNA)識別，并引導Cas9核酸酶到達識別部位，對目標序列進行酶切，從而降解外源DNA。此系統具體工作原理如下：crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物，該復合物能夠引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的目標序列靶位點剪切雙鏈DNA。通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的單鏈sgRNA(singleguide RNA)，引導Cas9對DNA進行定點切割。

作為一種RNA導向的雙鏈DNA結合蛋白，Cas9效應物核酸酶是已知的第一個統一因子(unifying factor)，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表達適當的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可連接到目標DNA，不影響Cas9的結合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列處帶來任何融合蛋白及RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。因此CRISPR/Cas9很快作為新的基因編輯工具被廣泛應用于遺傳工程、作物育種以及基因治療等領域。

艾滋病是一種難以根治的慢性傳染病。盡管聯合抗逆轉錄病毒治療可以控制HIV-1病毒的復制，維持患者的生存，但是藥物的副作用以及長期用藥產生的抗藥性等問題仍然存在，尋找更有效，且能改善患者生存質量的治療策略是艾滋病研究領域的重點和難點。艾滋病的基因治療已涉及到病毒感染宿主的整個生命周期，其中靶向病毒入侵門戶——輔助受體CXCR4和CCR5的治療策略已經在臨床上展現了曙光。2007年一位感染HIV-1且身患急性髓細胞性白血病的男子，經過異體移植CCR5基因天然缺失32個堿基(CCR5Δ32/Δ32)的供者骨髓后，至今仍未檢測到體內病毒的反彈，且身體狀況良好，被公認是全球第一例被治愈的艾滋病患者。后續的研究表明，表型的供者骨髓是實現根治的關鍵。然而天然攜帶CCR5Δ32/Δ32基因型的人數稀少，且存在HLA配型等問題，限制了此療法的推廣。此外，已有大量研究證實，HIV-1不同的毒株具有不同的共受體嗜性(CCR5嗜性，CXCR4嗜性，X4-R5雙嗜性等)，并且同一個患者體內也存在不同嗜性的HIV-1變異體。因此利用遺傳工具來修飾患者自身CCR5、CXCR4等基因，并自體回輸，用于控制和治療HIV-1感染，有可能最終實現功能性治愈。

CN 104480144 A公開了一種可用于艾滋病基因治療的CRISPR/Cas9重組慢病毒載體及其慢病毒，該重組慢病毒載體由慢病毒載體lentiCRISPR用BsmBI酶切后，連入帶BsmBI粘性末端的CXCR4特異靶序列重組而得。其采用的是人的CRISPR/Cas9重組慢病毒載體，其安全性不高。

恒河猴作為艾滋病研究的模型，具有小鼠所不具有的優勢：首先猴與人的遺傳背景更為接近；其次，研究已證實HIV-1起源于SIV，HIV-1感染人的病程和病理特征與SIV感染恒河猴十分相似。因此，用恒河猴感染SIVmac251作為慢性感染模型，對于臨床治療HIV-1感染具有重要的參考意義。以往的研究中，利用鋅指核酸酶(ZFN)或轉錄活化因子樣效應物核酸酶(TALEN)對獼猴的胚胎細胞進行基因的特異性修飾，用于獲得轉基因猴，但是對于分化的外周原代細胞的基因修飾，所能運用的技術手段有限。利用腺病毒或者腺相關病毒作為載體傳遞ZFN或TALEN能夠對外周血細胞進行適度的修飾，但是這兩種技術的運用較為復雜，而腺病毒本身對恒河猴有免疫原性，可能會影響基因修飾的效果。

因此采用SIV慢病毒載體，傳遞CRISPR/Cas9，既能提高感染原代細胞的效率，同時也能更為方便快捷高效地對目的基因進行修飾，提高基因修飾的安全性。

發明內容