[發明專利]一種接頭和通過高效率環化方式構建測序文庫的方法

在審

• 申請號: 201710053745.8
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN108342385A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 李洋;陳祖耕;王萍;廖小平
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B50/06
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

本發明，提供了一種接頭和通過高效率環化方式構建測序文庫的方法。具體地，本發明提供一種接頭，所述接頭為正義鏈和反義鏈形成的具有互補的突出末端的雙鏈核酸分子；所述雙鏈核酸分子上含有生物素標記。本發明還提供了一種所述接頭的制備方法，以及一種使用所述接頭通過環化方式構建DNA高通量測序文庫的方法。本發明中的接頭序列短、合成成本低、制備方法簡便且易于與文庫片段分離；構建測序文庫的方法相比其他長片段文庫，環化效率更高，能在測序之前鑒定構建是否成功，并能識別核酸片段錯誤連接的位置。

技術領域

本發明屬于基因組高通量測序技術領域，具體地，本發明涉及一種接頭和通過環化方式構建DNA高通量測序文庫的方法。

背景技術

全基因組測序對全面了解一個物種的基因組成、代謝通路和分子進化等有著非常重要的意義。近年來，第二代高通量測序技術取得了突飛猛進的發展，使得測序成本逐年下降，但是應用最廣的短插入片段文庫測序，由于無法跨越重復序列和二級結構等區域，使得基因組組裝往往只能得到一些片段而不是基因組全長。第三代測序技術雖然可以獲得較長的測序序列，但是成本一直居高不下，目前其推廣和應用程度遠低于第二代測序。如何改進文庫構建和測序方法，更加高效低成本地獲得較為完整的基因組序列，成為了高通量測序領域的研究熱點。

各大儀器和試劑公司，包括Illumina、Roche、Lucigen等，已能提供適用于第二代測序的長片段文庫構建試劑盒，但是這些方法很大程度上局限于核酸片段的大小，對于較大的核酸分子進行環化文庫構建的效率較低，并且還存在實驗過程復雜，成本和錯誤率都較高等缺點，使得其實際應用范圍較窄。

因此本領域迫切需要一種能夠有效提高環化效率和拼接準確度的長片段文庫構建方法。

發明內容

本發明的目的在于解決現有的DNA高通量測序建庫方法中長片段文庫環化效率低和錯誤率高等問題，提供一種能夠有效避免拼接錯誤的高效的長片段文庫構建方法。

為了達到以上目的，本發明提供一種新的接頭和通過環化方式構建測序文庫的方法，該方法適用于多種測序平臺。

在本發明的第一方面，提供了一種接頭，所述接頭為正義鏈和反義鏈形成的具有互補的突出末端的雙鏈核酸分子；其中，所述雙鏈核酸分子上含有生物素標記；

并且所述正義鏈的序列選自：SEQ ID NO：1；而所述反義鏈的序列選自下組：SEQID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在另一優選例中，所述雙鏈核酸分子中正義鏈的5’末端的核苷酸帶有磷酸基團。

在另一優選例中，所述雙鏈核酸分子中反義鏈上含有生物素標記。

在另一優選例中，所述雙鏈核酸分子中反義鏈上含有一個被生物素標記的胸腺嘧啶。

在另一優選例中，所述雙鏈核酸分子中正義鏈上含有生物素標記。

在另一優選例中，所述的反義鏈為SEQ ID NO.:2。

在本發明的第二方面，提供了一種本發明的第一方面所述的接頭的制備方法，包括：

(1)分別合成正義鏈和反義鏈核酸分子，其中至少一條鏈上含有生物素標記；和

(2)對所述正義鏈和反義鏈核酸分子進行混合后，先變性再退火，形成具有互補的突出末端的雙鏈核酸分子，即本發明的第一方面所述的接頭。

在另一優選例中，其中正義鏈核酸分子的5’末端的核苷酸帶有磷酸基團。

在另一優選例中，其中正義鏈核酸分子上含有生物素標記。

在另一優選例中，其中反義鏈核酸分子上含有生物素標記。

在另一優選例中，所述反義鏈核酸分子上含有一個生物素標記的胸腺嘧啶。