[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)液及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710053619.2
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN106701666A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛嘯虎;陳海佳;王一飛;戚康藝;張維敏
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)液及方法。

背景技術(shù)

心肌梗死是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損壞，是臨床上一種嚴(yán)重的缺血性心臟病。壞死后的心肌細(xì)胞逐漸被癱痕組織所取代，由于癱痕組織缺乏彈性,難以滿足心臟收舒功能的要求,為代償損失心肌細(xì)胞的功能,心臟逐漸發(fā)生退行性左心室重塑，心功能下降，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭,甚至猝死。臨床藥物和介入治療雖可以改善癥狀，但卻不能挽回受損的心肌細(xì)胞。心臟移植雖可以從根本上解決心室重構(gòu)問題，但因?yàn)槠涔w受限，醫(yī)療費(fèi)用太高而難以廣泛應(yīng)用。近年來的研究表明，心肌細(xì)胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌細(xì)胞也可以發(fā)生分裂和增殖。但是，由于其增殖能力較弱，不能滿足彌補(bǔ)喪失心肌細(xì)胞數(shù)量的要求而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)過程。近年來隨著干細(xì)胞技術(shù)和組織工程學(xué)研究的不斷深入，干細(xì)胞移植治療心肌梗死成為臨床研究的熱點(diǎn)。

干細(xì)胞的多向分化潛能及可塑性使心肌梗死心肌細(xì)胞再生成為可能，在人體的微環(huán)境作用下，干細(xì)胞定向歸巢至損傷處，可以多項(xiàng)分化成各種組織細(xì)胞及血管。目前用于心肌梗死治療研究的干細(xì)胞主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等。如專利CN105176920A、CN1536076A分別公開了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的方法。目前研究表明，在體外常用5-氮雜胞苷，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2等作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，如上述所提到的兩個(gè)專利均是采用5-氮雜胞苷作為誘導(dǎo)劑。

人胎盤來源的羊膜組織作為孕婦分娩后的廢棄物，來源廣、增殖快且不受倫理道德限制，是近幾年的研究熱點(diǎn)。羊膜是胎盤包裹胎兒面的一層半透明膜，其表面沒有神經(jīng)、血管、肌肉和淋巴等組織，可分離出羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。早在50多年前，科學(xué)家和臨床醫(yī)生們就已經(jīng)認(rèn)識到羊膜擁有一定的生物學(xué)作用。早期羊膜曾被用作覆蓋皮膚傷口的敷料，可以抗感染、減輕炎癥的發(fā)生，并且抑制細(xì)胞的免疫反應(yīng)，還可以刺激血管的生成。這些特點(diǎn)使它在多種疾病的輔助治療中得到了較為廣泛的應(yīng)用，例如治療燒傷，覆蓋手術(shù)傷口，更重要的是用于眼表重建術(shù)。其中人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human amnion mesenchymal cells,hAMSCs)來自于原條期的胚外中胚層，具有在一定條件下向多個(gè)細(xì)胞系分化潛能，向內(nèi)胚層分化，如肝細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞；向中胚層分化，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞；向外胚層分化，如神經(jīng)細(xì)胞等。

hAMSCs不僅具有干細(xì)胞的特征，且不排斥性及免疫效果，是細(xì)胞移植和組織工程的理想種子細(xì)胞。hAMSCs在體外使用合適的誘導(dǎo)劑同樣具有分化為心肌樣細(xì)胞的能力。hAMSCs這種功能特性極大地吸引了來自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，hAMSCs所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)發(fā)展新療法的機(jī)會。

然而，目前對于hAMSCs向心肌樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)的研究報(bào)道尚少。由于生物體是一個(gè)復(fù)雜的存在多誘導(dǎo)因素的有機(jī)體，不同的干細(xì)胞有不同的微環(huán)境，采用現(xiàn)有常規(guī)的誘導(dǎo)方法并不能使hAMSCs具有較高的誘導(dǎo)分化率。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)液，使得所述誘導(dǎo)液能夠使人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在向心肌樣細(xì)胞分化時(shí)具備較高的誘導(dǎo)分化率。同時(shí)，基于該誘導(dǎo)液本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)分化方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種誘導(dǎo)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)液，該誘導(dǎo)液為包括胎牛血清、5-氮雜胞苷、血管緊張素II和轉(zhuǎn)錄生長因子β1的DMEM/F12培養(yǎng)液。

針對現(xiàn)有技術(shù)中人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)分化率較低的問題，本發(fā)明在常用的5-氮雜胞苷(5-aza)基礎(chǔ)上，選擇血管緊張素II(Ang-II)和轉(zhuǎn)錄生長因子β1(TGFβ1)作為新的組分，三者相互作用提高了hAMSCs的誘導(dǎo)分化率。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述誘導(dǎo)液為包括10％胎牛血清、5-10μmol/L 5-氮雜胞苷、5-10μmol/L血管緊張素II和5-10μg/L轉(zhuǎn)錄生長因子β1的DMEM/F12培養(yǎng)液。

在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)液以DMEM/F12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)組分，同時(shí)包含如下之一組分：