[發明專利]一種誘導人羊膜間充質干細胞向心肌樣細胞分化的誘導液及方法

在審

• 申請號: 201710053619.2
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN106701666A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 葛嘯虎;陳海佳;王一飛;戚康藝;張維敏
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

1.一種誘導羊膜間充質干細胞向心肌樣細胞分化的誘導液，其特征在于，該誘導液為包括胎牛血清、5-氮雜胞苷、血管緊張素II和轉錄生長因子β1的DMEM/F12培養液。

2.根據權利要求1所述誘導液，其特征在于，該誘導液為包括10％胎牛血清、5-10μmol/L 5-氮雜胞苷、5-10μmol/L血管緊張素II和5-10μg/L轉錄生長因子β1的DMEM/F12培養液。

3.根據權利要求1所述誘導液，其特征在于，該誘導液為包括10％胎牛血清、5μmol/L 5-氮雜胞苷、5μmol/L血管緊張素II和5μg/L轉錄生長因子β1的DMEM/F12培養液；或包括10％胎牛血清、10μmol/L 5-氮雜胞苷、5μmol/L血管緊張素II和10μg/L轉錄生長因子β1的DMEM/F12培養液；或包括10％胎牛血清、10μmol/L 5-氮雜胞苷、10μmol/L血管緊張素II和5μg/L轉錄生長因子β1的DMEM/F12培養液；或包括10％胎牛血清、5μmol/L 5-氮雜胞苷、5μmol/L血管緊張素II和10μg/L轉錄生長因子β1的DMEM/F12培養液。

4.權利要求1-3任意一項所述誘導液在誘導羊膜間充質干細胞向心肌樣細胞分化和/或制備誘導羊膜間充質干細胞向心肌樣細胞分化的誘導試劑中的應用。

5.一種誘導羊膜間充質干細胞向心肌樣細胞分化的方法，其特征在于，將羊膜間充質干細胞先進行貼壁培養，然后更換權利要求1-3任意一項所述誘導液誘導培養，期間定期更換誘導液。

6.根據權利要求5所述方法，其特征在于，將羊膜間充質干細胞按1×10⁴cells/mL密度接種于含10％胎牛血清DMEM/F12培養液中貼壁培養24h，然后更換權利要求1-3任意一項所述誘導液，在37℃、5％CO₂、飽和濕度環境下靜置誘導培養4周，期間2-3天換液一次。

7.根據權利要求5或6所述方法，其特征在于，所述羊膜間充質干細胞為人羊膜間充質干細胞。

8.根據權利要求5或6所述方法，其特征在于，所述羊膜間充質干細胞由以下方法制備獲得：

用剪刀將羊膜從胎盤上剪下并清洗，然后剪成小塊加入胰蛋白酶消化，消化后再次剪碎，加入I型膠原酶消化，消化后過篩，加入含10％FBS的DMEM/F12完全培養基重懸細胞并進行培養，至細胞長滿80-90％傳代，定期更換新鮮的含10％FBS的DMEM/F12完全培養基。

9.根據權利要求8所述方法，其特征在于，所述傳代按照如下方法進行：

待原代細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養液，加入胰蛋白酶消化，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入含10％FBS的DMEM/F12培養液終止消化，離心收集細胞，加入適量含10％FBS的DMEM/F12完全培養基傳代培養，每隔3-4天傳代一次。