[發(fā)明專利]化學(xué)?酶法制備熊去氧膽酸

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710052978.6
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106701882A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 竺偉;高新星
• 申請（專利權(quán)）人: 尚科生物醫(yī)藥（上海）有限公司
• 主分類號: C12P33/06
• 分類號: C12P33/06;C12P33/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種化學(xué)-酶法制備熊去氧膽酸的方法。

背景技術(shù)

熊去氧膽酸(UDCA)是1927年日本正田氏從熊膽汁中首次分離出純結(jié)晶產(chǎn)品，1957年UDCA被成功合成并作為利膽劑用于臨床。1973年日本發(fā)現(xiàn)UDCA有溶解膽結(jié)石的作用,且具有毒性小、劑量小的優(yōu)點(diǎn)，從而引起世界各國的關(guān)注。熊去氧膽酸是一種無毒性親水膽酸，能競爭性的抑制毒性內(nèi)源性膽酸在回腸的吸收，通過激活鈣離子、蛋白激酶C組成的信號網(wǎng)絡(luò)，并通過激活分裂活性蛋白激酶來增強(qiáng)膽汁淤積肝細(xì)胞的分泌能力，使血液及肝細(xì)胞中的內(nèi)源性疏水膽酸濃度降低，達(dá)到抗膽汁淤積的作用。

熊去氧膽酸的國外市場需求量大，尤其是日本、韓國、歐美等國家，出口形勢較好，國內(nèi)市場也漸漸在擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，全球?qū)π苋パ跄懰嵝枨罅考s為1200噸，每年均有15％的增長，盡管日本人口較少，但是每年消耗熊去氧膽酸高達(dá)300噸，韓國也高達(dá)100噸以上。因此越來越多的科研工作者開始探索熊去氧膽酸的新制備工藝，力求降低熊去氧膽酸的現(xiàn)有產(chǎn)品價(jià)格。

目前熊去氧膽酸的制備方法分為化學(xué)法和生物法，由于化學(xué)法合成路線較長、反應(yīng)條件苛刻、收率低、產(chǎn)物立體選擇性差導(dǎo)致后處理純化步驟增多，人們逐漸關(guān)注于生物法制備UDCA的研究。

CN103012532公開了以牛羊膽酸為原料，經(jīng)酯化、3,7位乙酰化、12位氧化、脫氧、7位氧化、還原得到UDCA的方法，總收率為32％，產(chǎn)品純度最高為98.5％，合成路線如下：

該化學(xué)合成方法路線冗長，總收率較低，反應(yīng)條件苛刻，對環(huán)境影響較為嚴(yán)重，放大生產(chǎn)對設(shè)備要求較高，能耗較大，生產(chǎn)成本大幅度提高。

CN105861613公開了以鵝去氧膽酸(CDCA)為原料，在兩種酶7-αHSDH和7-βHSDH、輔酶NADP的作用下經(jīng)重結(jié)晶精制一步得到熊去氧膽酸的方法，收率最高為81％，合成路線如下：

該方法雖然收率較高為81％，但是由于原料CDCA通常都是用從禽膽汁中分離、提取、純化，而現(xiàn)實(shí)生活中存在禽膽汁量較少，難以收集的問題，所以該路線工業(yè)化放大生產(chǎn)受阻，難以滿足人們的需求。

CN102791876公開了原料膽酸(CA)經(jīng)氧化、7β-HSDH還原、3α-HSDH還原、12位化學(xué)法脫氧四步反應(yīng)得到UDCA，合成路線如下：

該路線的酶法制備步驟中底物濃度較低只有20g/L，僅停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，難以進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明公開了一種化學(xué)-酶法制備熊去氧膽酸的方法。

具體工藝路線如下所示：

合成步驟包括：

步驟a：去氧膽酸(化合物II)在12α-羥基類固醇脫氫酶(12α-HSDH)、輔酶、第一輔酶再生體系、磷酸鹽緩沖液的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)得到12-酮去氧膽酸(化合物III)；

步驟b：化合物III進(jìn)行脫羰基還原反應(yīng)得到膽石酸(化合物IV)；

步驟c：化合物IV在7α-羥化酶(7α-LCAH)催化作用下進(jìn)行羥基化反應(yīng)得到熊去氧膽酸(化合物I)。

進(jìn)一步說，步驟a中所述輔酶為NAD或NADP。

進(jìn)一步說，步驟a中所述第一輔酶再生體系為醇脫氫酶/丙酮體系或乳酸脫氫酶/丙酮酸體系，優(yōu)選為醇脫氫酶/丙酮體系。

進(jìn)一步說，步驟a中化合物II的濃度為20～100g/L，12α-羥基類固醇脫氫酶的濃度為5～10g/L，丙酮濃度為5～20％(V/V)，輔酶的濃度為0.01～0.1g/L，醇脫氫酶的濃度為1～5g/L，磷酸鹽緩沖液的濃度為40～80mM。

進(jìn)一步說，步驟a的氧化反應(yīng)在pH＝6～8，溫度為30～40℃進(jìn)行。

進(jìn)一步說，所述12α-羥基類固醇脫氫酶和醇脫氫酶源自尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司，優(yōu)選12α-HSDH101和KRED195。

進(jìn)一步說，步驟b中所述脫羰基還原反應(yīng)在180～220℃、水合肼作用下進(jìn)行。

進(jìn)一步說，步驟b中水合肼與化合物III的摩爾比為1:1～1:3。

進(jìn)一步說，步驟c的羥基化反應(yīng)是將化合物IV、7α-LCAH、輔酶、第二輔酶再生體系、磷酸鹽緩沖液按一定比例混合反應(yīng)得到。

進(jìn)一步說，步驟c中所述第二輔酶再生體系為醇脫氫酶/異丙醇體系。