[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于ARMS?PCR熔解曲線(xiàn)法的人類(lèi)ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710052182.0
• 申請(qǐng)日: 2017-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107460235A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉振;吳國(guó)祥;韓武梅;齊善康;金芬芬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海科醫(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 寧波江東全方專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)33242
• 代理人: 劉永斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種人類(lèi)ApoE基因檢測(cè)試劑盒，尤其是一種基于ARMS-PCR熔解曲線(xiàn)法的人類(lèi)ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)是一種糖蛋白，包括299個(gè)氨基酸，在人體脂質(zhì)代謝中起主要作用。ApoE通過(guò)多種途徑參與機(jī)體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，是影響機(jī)體血脂水平的重要內(nèi)在因素。ApoE基因與多種心腦血管疾病密切相關(guān)，包括高脂蛋白血癥及動(dòng)脈粥樣硬化性血管病、冠心病等癥。ApoE基因的多態(tài)性是這些疾病發(fā)展過(guò)程和藥物治療療效個(gè)體差異的主要原因。

ApoE基因型由主要兩個(gè)SNP決定的，即位于112位氨基酸的堿基(c.388T＞C) 和158位氨基酸的堿基(c.526C＞T)。依據(jù)112和158位氨基酸的不同組合，形成不同的基因型。ApoE基因有三個(gè)等位基因，即E2、E3和E4，共構(gòu)成6種不同的基因型：3種純合型(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三種雜合型(E3/E4、E2/E3、E2/E4)。

據(jù)報(bào)道，ApoE的E4攜帶者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)要高40％，并且他汀類(lèi)藥物對(duì)ApoE 的E4攜帶者療效往往不佳或無(wú)療效，而對(duì)ApoE的E2攜帶者的降脂作用最強(qiáng)。

因此對(duì)于APOE基因型的檢測(cè)可為臨床醫(yī)生確定患者基因型，為相關(guān)的疾病，如高脂血癥的產(chǎn)生原因提供一定的參考，并可輔助醫(yī)生對(duì)他汀類(lèi)藥物使用劑量、毒性反應(yīng)及療效進(jìn)行預(yù)測(cè)。

目前對(duì)基因SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，常見(jiàn)的方法有直接測(cè)序法，基因芯片雜交法， PCR-Taqman MGB探針?lè)中头ǎ琍CR高分辨率熔解曲線(xiàn)法，ARMS-PCR法等。這些方法在推廣上都或多或少存在如試劑檢測(cè)成本高，操作復(fù)雜，易產(chǎn)生污染，產(chǎn)生一定假陰性和假陽(yáng)性等缺陷。

1)直接測(cè)序法，是SNP位點(diǎn)分析的金標(biāo)準(zhǔn)，但該檢測(cè)方法受到測(cè)序儀器的限制，測(cè)序儀器昂貴，推廣困難。另外直接測(cè)序?qū)δ０辶恳蟾撸ǔＰ枰ㄟ^(guò)PCR擴(kuò)增富集目的片段后，進(jìn)行測(cè)序，操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)，且為開(kāi)管操作，容易造成污染。

2)基因芯片雜交法，目前市面上已有通過(guò)CFDA認(rèn)證的成型的檢測(cè)試劑盒，珠海賽樂(lè)奇生物技術(shù)有限公司的“載脂蛋白E(apoE)基因型檢測(cè)試劑盒(基因芯片法)”，該試劑盒采用PCR-基因芯片雜交法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的APOE基因片段，并與芯片上特異性核酸探針雜交，以區(qū)分確定APOE 的基因型。該檢測(cè)方法，仍然存在操作復(fù)雜，開(kāi)管操作，易造成污染的問(wèn)題，另外雜交芯片制作復(fù)雜，需要載玻片等耗材，大大提高了檢測(cè)成本。整個(gè)檢測(cè)周期需要3-4 個(gè)小時(shí)，效率不高。

3)PCR-Taqman MGB探針?lè)中头ǎ蚱洳僮骱?jiǎn)單，分型準(zhǔn)確，全程閉管操作，檢測(cè)周期短等特點(diǎn)，是目前比較主流的SNP分型方法。目前市面上也已有通過(guò)CFDA 認(rèn)證的成型檢測(cè)試劑盒，如武漢友芝友生物科技有限公司的“人類(lèi)SLCO1B1和ApoE 基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?”，然而其需要兩條Taqman-MGB探針，而MGB探針的合成價(jià)格是普通Taqman探針的幾倍，大大增加了檢測(cè)成本，且MGB 探針是屬于美國(guó)LIFE公司專(zhuān)利技術(shù)，會(huì)在原材料上受到較多限制。

4)PCR高分辨率熔解曲線(xiàn)SNP分型檢測(cè)技術(shù)，能高通量檢測(cè)基因的突變情況，試劑，且試劑成本低，只需要普通的熒光染料，而不需要特定探針，但是由于SNP 位點(diǎn)僅僅為一個(gè)堿基的變異，因此檢測(cè)儀器通常比普通的熒光PCR儀更為精密，對(duì)于溫度敏感性要求特別高，兩個(gè)不同堿基的變異，熔解溫度可能僅僅相差0.2℃，稍有不慎，或者儀器不穩(wěn)定，則很難進(jìn)行區(qū)分，因此受到儀器的影響很大因此普及受到限制。

5)ARMS-PCR，等位基因特異性擴(kuò)增法，也稱(chēng)擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。該法通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5`端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，只有突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，由于錯(cuò)配位于引物的 3`端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱(chēng)為ARMS。該方法通過(guò)采用PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳，從有無(wú)放映條帶來(lái)判斷結(jié)果，這種方法雖然不需要昂貴的儀器，但電泳操作，增加了PCR污染的機(jī)會(huì)，而且耗時(shí)費(fèi)力。

因此，如何解決檢測(cè)APOE基因多態(tài)性過(guò)程中存在的問(wèn)題，推行一種簡(jiǎn)單易行，物美價(jià)廉，沒(méi)有特殊昂貴儀器限制的檢測(cè)方法，成為亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容