[發(fā)明專利]一種基于ARMS?PCR熔解曲線法的人類ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710052182.0
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN107460235A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉振;吳國祥;韓武梅;齊善康;金芬芬
• 申請（專利權(quán)）人: 上海科醫(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 寧波江東全方專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)33242
• 代理人: 劉永斌

1.一種ARMS-PCR熔解曲線檢測方法，其特征在于，包括：

將ARMS-PCR技術(shù)與熔解曲線法相結(jié)合，針對APOE基因的c.388T＞C位點和c.526C＞T位點，分別各設(shè)計兩個ARMS-PCR5’端引物和一個通用的3’端反向引物；其中5’端的兩個ARMS引物，一個與正常DNA互補(bǔ)，一個與突變DNA互補(bǔ)，為了將擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線差異增大，人為地在其中一條ARMS引物的5’末端，引入人工的單堿基重復(fù)序列，使兩個ARMS引物擴(kuò)增出對應(yīng)特異片段時的熔解溫度差異增大；

三條引物同時放入一管PCR進(jìn)行擴(kuò)增，兩條ARMS引物選擇性地結(jié)合在與各自3’端完全互補(bǔ)的模板上進(jìn)行擴(kuò)增，若為純合模板，只有其中一條ARMS引物，即3’端可以與模板完全匹配的才能進(jìn)行擴(kuò)增，則擴(kuò)增出對應(yīng)的特異PCR片段，而若為雜合模板，則兩條ARMS引物都可以找到3’端完全互補(bǔ)配對的模板進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到兩個特異性目標(biāo)片段；

在加入了熒光染料的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的PCR片段都帶有熒光染料，隨后利用熒光PCR儀的熔解曲線步驟進(jìn)行分型，兩個分別對應(yīng)不同SNP位點的ARMS引物擴(kuò)增的目的片段的熔解溫度最后通過熒光信號反應(yīng)出來，由于片段差異較大，則可進(jìn)行準(zhǔn)確的SNP分型。

2.一種基于權(quán)利要求1所述的ARMS-PCR熔解曲線檢測方法的人類ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，包括：檢測ApoE基因多態(tài)性的引物，其中，所述引物包括分別檢測c.388T＞C位點和c.526C＞T位點的兩組引物；所述第一組引物為針對c.388T＞C位點野生型(T)的特異性上游引物如SEQ NO.1所示和針對突變型的(C)特異性上游引物如SEQ NO.2所示，以及c.388T＞C位點野生型(T)的特異性上游引物和突變型的(C)特異性上游引物共用的下游引物如SEQ NO.3所示；

所述第二組引物為針對c.526C＞T位點野生型(C)的特異性上游引物如SEQ NO.4所示和針對突變型的(T)特異性上游引物如SEQ NO.5所示，以及c.526C＞T位點野生型(C)的特異性上游引物和突變型(T)的特異性上游引物共用的下游引物如SEQ NO.6所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，c.388T＞C位點擴(kuò)增引物混合液，c.526C＞T位點擴(kuò)增引物混合液，3種參考陽性對照液，陰性對照液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于：在c.388T＞C位點擴(kuò)增引物混合液中，上述針對c.388T＞C位點野生型(T)的特異性上游引物和針對突變型的(C)特異性上游引物，及c.388T＞C位點共用下游引物，三種引物的濃度比例為1∶2∶3；在c.526C＞T位點擴(kuò)增引物混合液中，上述針對c.526C＞T位點野生型(C)的特異性上游引物和針對突變型的(T)特異性上游引物，及c.526C＞T位點擴(kuò)增共用下游引物的濃度比例為2∶1∶3。

5.根據(jù)權(quán)利要求2，3或4所述的檢測試劑盒，其特征在于：在PCR擴(kuò)增終體系中，上述針對c.388T＞C位點野生型(T)的特異性上游引物終濃度為0.25μM，針對突變型的(C)特異性上游引物終濃度為0.5μM，c.388T＞C位點擴(kuò)增共用下游引物終濃度為0.75μM；上述針對c.526C＞T位點野生型(C)的特異性上游引物終濃度為0.5μM，針對突變型的(T)特異性上游引物終濃度為0.25μM，c.526C＞T位點擴(kuò)增共用下游引物的濃度為0.75μM。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于：PCR擴(kuò)增預(yù)混液包括PCR緩沖液、dNTPs、HotStart Taq DNA聚合酶，和SYBR熒光染料。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于：所述參考陽性對照液分別作為所述試劑盒的分型結(jié)果確認(rèn)的參考模板，對所述試劑盒檢測人類ApoE基因多態(tài)性檢測過程中的PCR擴(kuò)增，分型結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于：所述陰性對照液為純水。