[發明專利]一種基于間接競爭酶聯免疫法定量檢測油胺枝接聚琥珀酰亞胺高分子納米藥物載體的方法

有效

• 申請號: 201710051804.8
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106706894B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 張明翠;曹以婷
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司34107
• 代理人: 任晨晨

1.一種基于間接競爭酶聯免疫法定量檢測油胺接枝聚琥珀酰亞胺（PSI_OAm）高分子納米藥物載體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

a、制備PSI_OAm包被抗原和免疫原；

b、制備PSI_OAm抗體：

c、將PSI_OAm包被抗原經包被液稀釋后包被于酶標板中，封閉、加入不同濃度的PSI_OAm標準液，以PSI_OAm抗體作為一抗，HRP標記的羊抗兔抗體作為二抗，進行間接競爭酶聯免疫分析法；

d、以PSI_OAm標準液濃度的對數為橫坐標，吸光度值為縱坐標建立標準曲線，從而定量檢測出PSI_OAm的濃度；

所述步驟a具體包括以下步驟：

a-1、水解PSI_OAm，得到水解后的PSI_OAm溶液；

a-2、向水解后的PSI_OAm溶液中，加入羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和牛血清白蛋白，20-30℃溫育3-6小時后，離心分離，取沉淀分散于pH=7.4的PBS緩沖液中即得到PSI_OAm免疫原溶液；

a-3、向水解后的PSI_OAm溶液中，加入羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和雞卵清白蛋白，20-30℃溫育3-6小時后，離心分離，取沉淀分散于pH=7.4的PBS緩沖液中即得到PSI_OAm包被抗原溶液；

a-4、將PSI_OAm免疫原溶液和PSI_OAm包被抗原溶液分別置于透析袋中，以pH=7.4的PBS緩沖液透析12-16h后收集，即可得到PSI_OAm免疫原和PSI_OAm包被抗原。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標準曲線的線性方程為A=1.256-0.148lgC，其中A為490nm處吸光度值，C為PSI_OAm濃度。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步驟a-1具體包括以下步驟：將濃度為60mg/mL的油胺接枝聚琥珀酰亞胺的三氯甲烷溶液0.1-0.5mL，分散在1-6mL 0.1-1mmol/L NaOH中，超聲5-10min，得到的乳狀溶液在50-65℃下攪拌5-15min，反應結束后離心分離，沉淀分散在1-5mL pH=7.4的PBS緩沖液中，得到水解后的PSI_OAm。

4.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，水解后的PSI_OAm的濃度為1~10mg/mL。

5.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步驟a-2中，水解后的PSI_OAm溶液、羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺與牛血清白蛋白的比值為2mL：0.1mg：0.7mg：1mg；所述步驟a-3中，水解后的PSI_OAm溶液、羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺與雞卵清白蛋白的比值為2mL：0.1mg：0.7mg：1mg。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟b具體包括以下步驟：

b-1、首次免疫：將PSI_OAm免疫原與福氏完全佐劑等體積比混合后，背部皮下多點注射到動物體內，注射8~10個點，注射量為1mL/只；首次免疫三周后進行加強免疫；

b-2、加強免疫：將PSI_OAm免疫原與福氏不完全佐劑等體積比混合后，采取同樣的方式注射到動物體內，注射量為1mL/只；此后每隔一周再進行一次加強免疫，期間采血測效價，直到抗體效價達到1:32000，進行最后一次加強免疫，從動物頸動脈采血，取血清部分制得PSI_OAm抗體。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟c具體包括以下步驟：

c-1、包被：用包被緩沖液將PSI_OAm包被抗原稀釋100倍，包被96孔酶標板，每孔100μL，4℃冰箱過夜；

c-2、封閉：PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3~5min，然后加入1wt%酪蛋白封閉，每孔200μL， 37℃溫育1~2h；

c-3、加樣競爭：PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3~5min，然后將50μL 不同濃度的PSI_OAm標準液和50μL PSI_OAm抗體分梯度加入各孔中，37℃溫育1~2h；

c-4、加酶：PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3~5min，然后每孔加入100μL PBS稀釋的稀釋比為1/1000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，37℃溫育2~4h；

c-5：顯色: PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3~5min，然后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液進行顯色反應，37℃溫育0.5~1h；

c-6、終止：每孔加入50μL 2mol/L的H₂SO₄終止反應，在酶標儀上測定各孔在490nm處的吸光值。