[發明專利]防齲轉基因植物疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 201710051684.1
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106868029A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 劉建國;管曉燕;田源;喻正文;白國輝;吳家媛;王方遠;吳明松;王倩;陳彬
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/82;A01H5/00;A61K39/09;A61P31/04;A61P1/02;A01H5/08;A23L19/00;A23L33/185
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙)50217
• 代理人: 黃書凱

本發明屬于口腔預防醫學技術領域，具體涉及一種防齲轉基因植物疫苗及其制備方法。

背景技術

齲病(Dental caries)是人類最常見的口腔疾病之一，與同心血管疾病、癌癥并稱為人類三大疾病，嚴重威脅著人們的口腔健康。目前在我國齲病發生率有上升趨勢，老年人群患齲率高達98.40％，齲均14.65顆。找到控制齲病的有效措施仍是當前非常緊迫的任務。但齲病又是一種非致死性疾病，在尋找控制齲病的有效免疫措施時，必須充分考慮治療方案以及使用制劑的高效、安全、價廉物美，以及預防接種方法易于被人群接受。

變異鏈球菌(Streptococcus mutans)為革蘭氏染色陽性的球菌，能夠與牙面緊密粘附并定植于牙面，產生酸性代謝產物，引起牙齒脫礦，最終導致齲病發生。變異鏈球菌是導致人類齲病的一類主要致病菌。變異鏈球菌壁相關蛋白A(wall-associated protein A gene,wapA)、葡聚糖結合蛋白(glucan-bind proteins,GBPs)、致齲毒力因子的表面蛋白(surface protein antigen,PAc)和葡糖基轉移酶(glucosyltranferaes,GTFs)是變異鏈球菌的重要抗原物質。這些抗原成分參與介導細菌的粘附，在免疫學方面有著極為重要的意義。其中，表面蛋白(PAc)和葡糖基轉移酶(GTFs)是變異鏈球菌中最重要的致齲毒力因子。表面蛋白是變異鏈球菌的主要粘結素，介導牙面的非蔗糖依賴型粘附。研究認為，表面蛋白(PAc)結構中的A區是主要粘附功能區，可與糖蛋白結合，介導變異鏈球菌對牙面的初始附著。表面蛋白(PAc)結構中的A區富集T、B細胞表位，是研制防齲疫苗的主要靶點抗原。研究表明，當變異鏈球菌毒力因子PAc作為抗原免疫動物后，機體的體液免疫和黏膜免疫應答被激發，產生特異性的抗體，初步證明利用PAc免疫動物后，可有效抑制細菌在牙面的粘附，從而降低患齲率。葡糖基轉移酶(GTFs)作為另一種主要的致齲毒力因子，可通過蔗糖合成葡聚糖，介導細菌在牙面的蔗糖依賴型粘附。GTFs包含兩個免疫活性區，能使變異鏈球菌與牙面緊密結合，分別是葡聚糖結合區(glucan binding region,GLU)和催化功能區(catalytic region,CAT)。PAc和GTFs是變異鏈球菌致病的主要毒力因子，在其分子中存在著相應的粘附功能區以及具有免疫原性的T、B細胞抗原決定簇，能誘導產生特異性唾液sIgA抗體，sIgA抗體可以抑制這兩種毒力因子的功能，阻止變異鏈球菌在牙面附著，從而抑制齲病的發生和發展。

IgG抗體也具有抑制齲病的發生和發展的重要作用。

霍亂毒素B亞單位(CTB)是一種較理想的免疫佐劑，它能與抗原呈遞細胞(antigen presenting cells，APC)等有核細胞表面神經節苷脂GM1受體特異性結合，具有調節APC反應、T細胞反應和抗體產生的作用，能誘導機體產生強烈的系統和局部粘膜免疫應答，在疫苗的研究中已被廣泛的使用。

免疫應答反應主要分為初次應答和再次應答。初次應答時，機體僅產生少量抗體且抗體生成緩慢，而再次應答時機體迅速發生免疫應答，產生大量的抗體。再次免疫應答是由記憶性B細胞(memory B cell,Bm)誘導。Bm是初次免疫應答后克隆消除保留下來的高親和力細胞，當再次受同一抗原刺激，Bm快速分化成漿細胞，介導迅速的記憶性應答，產生高滴度的抗體，同時維持Bm庫的更新。Bm在體液免疫中扮演十分重要的角色，對漿細胞的產生、抗體的生成、記憶持久的免疫保護起關鍵作用；預示誘導盡可能多的Bm形成是加強轉基因植物口服疫苗黏膜免疫效果的有效策略。

無功能糖基轉移酶樣蛋白(DOCK8)是GTP-交換因子Rho-Rac家族成員之一，其核心功能區是DHR。在靜息B細胞遭遇抗原時，DOCK8促進抗原信號存留，促使B細胞進入淋巴結的生發中心，并分化為長效Bm，維持長效免疫。B細胞還通過自身表達的DOCK8分子招募胞內的整合素ICAM-1向Th細胞和B細胞間的免疫突觸區域聚集，促進Th細胞活化B細胞第二信號的傳導，發揮生物活性作用。預示DOCK8可能是Bm形成及其在體內長期留存的關鍵。

近年來各種轉基因技術的創立和改進，使基因的轉移以及轉基因植物的再生不再是轉基因植物可食疫苗研究的限制因素；基因轉入宿主后的高效表達及其遺傳穩定性、表達蛋白的抗原性和免疫反應性、口服免疫機制、提高植物表達蛋白的利用率、利用安全篩選標記或刪除選擇標記的策略、培育安全的轉基因植物等問題，是當前轉基因植物口服疫苗研究的關鍵。