[發明專利]防齲轉基因植物疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 201710051684.1
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106868029A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 劉建國;管曉燕;田源;喻正文;白國輝;吳家媛;王方遠;吳明松;王倩;陳彬
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/82;A01H5/00;A61K39/09;A61P31/04;A61P1/02;A01H5/08;A23L19/00;A23L33/185
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙)50217
• 代理人: 黃書凱

1.一種防齲DNA序列，該DNA序列包括變異鏈球菌UA159的致齲毒力因子的表面蛋白A區編碼基因PacA和葡糖基轉移酶(GTF)催化區編碼基因cat，佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區DHR編碼基因，以及番茄果實特異性啟動子基因E8。

2.根據權利要求1所述的防齲DNA序列的制備方法，包括以下步驟：1)、將上述E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段來構建融合基因表達質粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，2)、將該融合基因表達質粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR插入到pCAMBIA2301雙元穿梭載體中，構建pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質粒，3)、將該pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重組質粒轉化感受態細胞E.coli JM109；獲得所述防齲DNA序列。

3.根據權利要求2的制備方法，所述防齲DNA序列如SEQ ID No1所示。

4.將權利要求1-3任意一項所述的防齲DNA序列轉化番茄，并培育獲得防齲轉基因番茄的轉化方法。

5.根據權利要求4所述的轉化方法，包括步驟：1)、將上述DNA序列經添加植物信號肽、內質網靶向序列和柔性肽基因修飾后，插入攜帶番茄果實特異性啟動子的植物表達載體中，構建穩定高效的轉基因植物表達質粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR并轉化番茄，2)、將選擇性標記基因Km和GUS去除，篩選出不帶標記基因、遺傳穩定、表達高效的轉基因番茄植株。

6.根據權利要求5所述的轉化方法，包括步驟：

1)、將所述包含上述防齲DNA序列的重組質粒添加植物信號肽、內質網靶向序列和柔性肽基因進行修飾；

2)、插入攜帶番茄果實特異性啟動子E8的植物表達載體中，構建穩定高效的轉基因植物表達質粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR；

3)、去除步驟2)所獲得的轉基因植物表達質粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR中真核生物中的標記抗性基因Km和GUS，保留原核生物中的Km基因作為篩選；

4)、將步驟3)得到的表達質粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR轉化到農桿菌感受態細胞EHA105菌株中；

5)、將步驟4)得到的成功轉化的農桿菌采用葉片注射法充分侵染番茄子葉細胞，將大量T-DNA轉入番茄子葉細胞內，將農桿菌侵染過的番茄子葉細胞接種到MS培養基中，經過培養后得到轉基因番茄植株；

6)、提取培養步驟5)得到的番茄子葉細胞的總RNA；

7)、將步驟6)得到的RNA逆轉錄為cDNA；

8)、將步驟7)得到的cDNA進行PCR擴增檢測；

9)、將步驟6)得到的cDNA進行GUS檢測，確認防齲DNA序列的轉化情況良好。

7.根據權利要求5和6的轉化方法培育得到的轉基因番茄，該轉基因番茄植株中表達了防齲植物蛋白，防齲植物蛋白作為一種可食用的口服防齲轉基因疫苗。

8.包含權利要求5和6的轉化方法培育得到的轉基因番茄果實的防齲食品。