[發(fā)明專利]一個聚合常用篩查靶標的轉(zhuǎn)基因油菜SD-rapeseed及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710049122.3
• 申請日: 2017-01-23
• 公開（公告）號: CN106834346B
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 武玉花;李俊;李允靜;曾新華;劉芳;吳剛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/20;C12N15/10;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

1.一個聚合常用篩查靶標的轉(zhuǎn)基因油菜SD-rapeseed的應(yīng)用，其特征在于：

①以該轉(zhuǎn)基因油菜的種子作為候選物制備轉(zhuǎn)基因油菜篩查檢測基體標準物質(zhì)；

②以該轉(zhuǎn)基因油菜的葉片作為候選物制備轉(zhuǎn)基因油菜篩查檢測基因組DNA標準物質(zhì)；所述轉(zhuǎn)基因油菜SD-rapeseed攜帶11個常用的轉(zhuǎn)基因篩查靶標，序列如SEQ ID NO.1，包括3個啟動子P-35S、P-FMV35S和P-NOS，4個標記基因Bar、NPTII、HPT和Pmi，4個終止子T-NOS、T-35S、T-g7和T-e9；

P-35S的序列如SEQ ID NO.2、P-FMV35S的序列如SEQ ID NO.3、P-NOS的序列如SEQ IDNO.4、Bar的序列如SEQ ID NO. 5、NPTII的序列如SEQ ID NO.6、HPT的序列如SEQ ID NO.7、Pmi的序列如SEQ ID NO.8、T-NOS的序列如SEQ ID NO.9、T-35S的序列如SEQ ID NO.10、T-g7的序列如SEQ ID NO.11和T-e9的序列如SEQ ID NO.12；

所述轉(zhuǎn)基因油菜SD-rapeseed中只有一個讀碼框P-NOS-NPTII-T-NOS正常表達，其他基因或元件均無活性；所述轉(zhuǎn)基因油菜SD-rapeseed的制備方法如下：

（1）以常規(guī)油菜品種中雙6號作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將聚合了所述11個常用的轉(zhuǎn)基因篩查靶標的T-DNA，轉(zhuǎn)化到油菜中，獲得T0代轉(zhuǎn)基因油菜植株；

（2）利用伯樂公司QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)，從11個外源靶標中隨機選擇HPT代表外源基因拷貝數(shù)，選擇內(nèi)標準基因CruA表征油菜的基因組；通過檢測HPT和內(nèi)標準基因CruA的拷貝數(shù)的比值，鑒定出T0代中HPT基因為單拷貝的轉(zhuǎn)基因油菜植株，利用微滴數(shù)字PCR分別檢測其他10個外源元件與內(nèi)標基因CruA的比值，鑒定出所有外源基因均為單拷貝的純合單株；

（3）將T0代單拷貝轉(zhuǎn)基因植株自交，收獲并種植T1代種子；每個單株的T1代種植30棵；通過定性PCR檢測，拔除陰性植株并記錄；采用微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)，分別對T1代植株中的篩查元件HPT和作物內(nèi)標基因CruA的拷貝數(shù)進行檢測，通過二者的比值篩選出純合轉(zhuǎn)基因單株；油菜純合體比值為1：2，雜合體比值為1：4；選擇綜合性狀最好的單拷貝純合轉(zhuǎn)基因單株。

2.一個聚合常用篩查靶標的轉(zhuǎn)基因油菜的制備方法，其特征在于，所述方法的步驟如下：

（1）以常規(guī)油菜品種中雙6號作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將聚合了11個常用的轉(zhuǎn)基因篩查靶標的T-DNA，轉(zhuǎn)化到油菜中，獲得T0代轉(zhuǎn)基因油菜植株，所述11個常用的轉(zhuǎn)基因篩查靶標序列如SEQ NO.1，包括3個啟動子P-35S、P-FMV35S和P-NOS，4個標記基因Bar、NPTII、HPT和Pmi，4個終止子T-NOS、T-35S、T-g7和T-e9；

P-35S的序列如SEQ ID NO.2、P-FMV35S的序列如SEQ ID NO.3、P-NOS的序列如SEQ IDNO.4、Bar的序列如SEQ ID NO. 5、NPTII的序列如SEQ ID NO.6、HPT的序列如SEQ ID NO.7、Pmi的序列如SEQ ID NO.8、T-NOS的序列如SEQ ID NO.9、T-35S的序列如SEQ ID NO.10、T-g7的序列如SEQ ID NO.11和T-e9的序列如SEQ ID NO.12；

（2）利用伯樂公司QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)，從11個外源靶標中隨機選擇HPT代表外源基因拷貝數(shù)，選擇內(nèi)標準基因CruA表征油菜的基因組；通過檢測HPT和內(nèi)標準基因CruA的拷貝數(shù)的比值，鑒定出T0代中HPT基因為單拷貝的轉(zhuǎn)基因油菜植株，利用微滴數(shù)字PCR分別檢測其他10個外源元件與內(nèi)標基因CruA的比值，鑒定出所有外源基因均為單拷貝的純合單株；

（3）將T0代單拷貝轉(zhuǎn)基因植株自交，收獲并種植T1代種子；每個單株的T1代種植30棵；通過定性PCR檢測，拔除陰性植株并記錄；采用微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)，分別對T1代植株中的篩查元件HPT和作物內(nèi)標基因CruA的拷貝數(shù)進行檢測，通過二者的比值篩選出純合轉(zhuǎn)基因單株；油菜純合體比值為1：2，雜合體比值為1：4；選擇綜合性狀最好的單拷貝純合轉(zhuǎn)基因單株。