[發(fā)明專利]卡泊芬凈發(fā)酵中間體的發(fā)酵方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710048169.8
• 申請(qǐng)日: 2017-01-20
• 公開（公告）號(hào): CN106755224B
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁建棟;王其龍;別一
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 信泰制藥（蘇州）有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/04
• 分類號(hào): C12P21/04;C12R1/645
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗真菌藥物的微生物發(fā)酵，具體涉及紐莫康定B0的微生物發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

棘白菌素化合物發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，是一類具有六元環(huán)肽和不同脂肪酸側(cè)鏈的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，能夠特異性地作用于真菌細(xì)胞壁，非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制真菌細(xì)胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性，從而能夠起到抗菌效果，且不對(duì)人體產(chǎn)生影響。紐莫康定B₀的半合成衍生物卡泊芬凈是首個(gè)被報(bào)道的棘白菌素類化合物，2001年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于曲霉菌感染的治療。目前，卡泊芬凈已成為全身用抗真菌藥市場(chǎng)的王牌藥物。

紐莫康定B0是由霉菌Glarea lozoyensis發(fā)酵合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

紐莫康定B0 Cas：135575-42-7

Glarea lozoyensis的發(fā)酵產(chǎn)物主要有A0和B0兩種有效產(chǎn)物，除此之外，發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)多種環(huán)狀六肽的結(jié)構(gòu)類似物，其中C0的結(jié)構(gòu)和B0最為接近，兩者的結(jié)構(gòu)差異在于B0中的反式3-羥基脯氨酸，在C0中是反式4-羥基脯氨酸。在實(shí)際生產(chǎn)中，主要采用的是樹脂柱工藝對(duì)紐莫康定B0進(jìn)行提純，柱層析應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，費(fèi)時(shí)，溶劑使用量大，易造成環(huán)境污染，且原料損耗大，使得生產(chǎn)成本大幅提高，C0是紐莫康定B0的異構(gòu)體，在結(jié)構(gòu)上的差異表現(xiàn)為一個(gè)羥基位置的不同；C0雜質(zhì)不能在反相色譜中與紐莫康定B0分離，只有通過(guò)正相色譜分離。發(fā)酵液中的C0雜質(zhì)一般10％，如果不能得到有效的控制，最后得到的是紐莫康定B0和C0的混合物。C0雜質(zhì)能參與后續(xù)反應(yīng)，嚴(yán)重影響醋酸卡泊芬凈的質(zhì)量。

紐莫康定C0 Cas：144074-96-4

發(fā)酵過(guò)程中結(jié)構(gòu)類似物的有效控制，能提高后期的分離效率，降低生產(chǎn)成本，因此如何提高B0效價(jià)同時(shí)降低副產(chǎn)物的比例，是研究人員關(guān)注的方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種新的紐莫康定B0的發(fā)酵方法，該方法在提高紐莫康定B0發(fā)酵單位的同時(shí)，還能降低發(fā)酵液中紐莫康定C0的含量，在該方法中使用的菌種為Glarea lozoyensis，所述發(fā)酵條件如下：

發(fā)酵培養(yǎng)基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH₂PO₄0.15％，七水合硫酸鎂0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。

發(fā)酵過(guò)程中溫度24～26℃，起始通氣量0.5～1.0VVM，罐壓0.04～0.06Mpa。發(fā)酵過(guò)程中逐漸調(diào)高通氣量與轉(zhuǎn)速使溶氧不低于20％，轉(zhuǎn)速最大600轉(zhuǎn)，通氣量最大1.2VVM。

發(fā)酵24h后，開始流加氨水，控制pH5.0～5.4。

發(fā)酵48h后，開始補(bǔ)加維生素b5，按照培養(yǎng)基的體積，添加量為20～40mg/l。

發(fā)酵60h后，開始流加乳糖，流加速度為1.5～2.5％/天(質(zhì)量體積比)，使發(fā)酵液總糖濃度控制在1～3％之間，直到發(fā)酵結(jié)束。

發(fā)酵72h后(通氣量與轉(zhuǎn)速已調(diào)至上限)，根據(jù)溶氧量變化調(diào)節(jié)pH控制范圍，直到發(fā)酵結(jié)束：溶氧量不低于45％時(shí)，控制pH5.0～5.4；溶氧量為35％～45％時(shí)，控制pH5.4～5.8；溶氧量為25％～35％時(shí)，控制pH5.8～6.2；溶氧量低于25％時(shí)，控制pH6.2～6.6。

發(fā)酵培養(yǎng)期共10天，10天后放罐。

本發(fā)明培養(yǎng)基采用稀配方，發(fā)酵過(guò)程中流加乳糖和氨水，能夠有效降低菌體粘度，提高通氣效果，同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中嚴(yán)格控制pH。

流加乳糖后，發(fā)酵液總糖濃度控制在1～3％之間，在這個(gè)范圍內(nèi)菌絲的正常生長(zhǎng)代謝是穩(wěn)定的，過(guò)低則影響正常代謝，過(guò)高則不利于下一步的放罐提取。

且該方法在發(fā)酵液中補(bǔ)加維生素b5，使得紐莫康定C0的含量可由原來(lái)的約6％降至1.5％。

現(xiàn)有紐莫康定B0的發(fā)酵技術(shù)中，紐莫康定B0的發(fā)酵單位約為800～1000mg/l，本發(fā)明發(fā)酵方法可將發(fā)酵單位提高至2000～2500mg/l，且紐莫康定C0的含量大幅下降。

具體實(shí)施例

實(shí)施例1

發(fā)酵菌種：Glarea lozoyensis

發(fā)酵培養(yǎng)基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH₂PO₄0.15％，七水合硫酸鎂0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。

50L發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)基30L，121℃消毒30分鐘。種量1.5L，發(fā)酵液培養(yǎng)溫度25℃，起始通氣量0.9VVM，200轉(zhuǎn)，罐壓0.05Mpa，發(fā)酵過(guò)程中逐漸調(diào)高通氣量與轉(zhuǎn)速使溶氧不低于20，轉(zhuǎn)速最大600轉(zhuǎn)，通氣量最大1.2VVM。發(fā)酵24h后，開始流加氨水，控制pH5.0～5.4。發(fā)酵48h后，開始補(bǔ)加維生素b5，添加量為30mg/l。發(fā)酵60h后，開始流加乳糖，流加速度為2.0％/天(質(zhì)量體積比)，使發(fā)酵液總糖濃度控制在1～3％之間，直到發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵72h后(此時(shí)通氣量與轉(zhuǎn)速已調(diào)至上限)，根據(jù)溶氧變化調(diào)節(jié)pH控制范圍，直到發(fā)酵結(jié)束：溶氧量不低于45％時(shí)，控制pH5.0～5.4，96h溶氧量為35％～45％，控制pH5.4～5.8，110h溶氧量為25％～35％，控制pH5.8～6.2，130h溶氧低于25％，控制pH6.2～6.6，144h溶氧回升至25％，控制pH5.8～6.2，168h溶氧回升至35％，并維持在35％～45％之間，控制pH5.4～5.8，240h發(fā)酵結(jié)束，放罐，測(cè)定紐莫康定B0的發(fā)酵單位為2345mg/l，紐莫康定C0的含量為1.5％。