[發明專利]一種尿蛋白制備方法及尿蛋白質組的檢測方法

在審

• 申請號: 201710048099.6
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108333263A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 秦鈞;冷文川;倪曉天;路天元;甄蓓;王廣舜;孫長青;鐘博文
• 申請（專利權）人: 北京蛋白質組研究中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京驥馳知識產權代理有限公司 11422
• 代理人: 唐曉峰

本發明公開了一種尿蛋白質組的檢測方法，包括尿蛋白的制備、在蛋白或肽水平的分離、質譜鑒定，其特征在于，所述尿蛋白制備方法包括下面步驟(1)將尿液樣品在常溫下超速離心一段時間，棄去上清液，保留沉淀；(2)向步驟(1)所述的沉淀中加入適量的重懸緩沖液使沉淀重懸；(3)向步驟(2)所得的重懸液中加入能打開二硫鍵的還原劑，于37?80℃溫度下加熱10?60分鐘；(4)向步驟(3)所得的溶液中添加清洗緩沖液，然后高速離心一段時間，棄去上清，保留沉淀；(5)用消化緩沖液重新溶解步驟(4)所得的沉淀，之后進行蛋白的溶液內酶解，或用一維電泳(SDS?PAGE)進行蛋白分離。本發明方法簡化了尿蛋白的制備過程、提高了檢測的準確性和重復性，并且可用于高通量定量深度尿蛋白質組檢測。

技術領域

本發明涉及一種尿蛋白制備方法及尿蛋白質組的檢測方法，特別涉及可用于高通量定量深度尿蛋白質組檢測的尿蛋白制備方法及尿蛋白質組的檢測方法。

背景技術

尿液是臨床檢驗中除血液外最常用的體液樣本，尿常規中對膽紅素、葡萄糖、酮體、蛋白、血細胞等指標的檢測被用于各種疾病的診斷或療效監測。鑒于尿液檢測在健康醫學方面的重要價值，世界各國科學家一直在利用蛋白質組學技術試圖從尿液中找到新的用于疾病診斷、預后判定、療效監測的蛋白標志物。

尿蛋白質組的檢測過程包括尿蛋白的制備、在蛋白或肽水平的分離、質譜鑒定。目前常用的尿蛋白制備方法包括以下3種：(1)有機溶劑沉淀法：包括用各種濃度的乙酸、丙酮、乙腈、氯仿、乙醇、甲醇等；(2)多步離心法，如先用1000-17000g離心5-15分鐘去除細胞殘渣或膜碎片，然后再用200000g離心60-120分鐘收集沉淀部分尿蛋白；(3)離心超濾法，在利用常規離心去除尿樣中的細胞殘渣或膜碎片后，利用不同規格截留分子量的超濾離心管濃縮富集尿蛋白。雙向電泳是尿蛋白常用的分離方法，分離后每個蛋白點進行膠內酶切后利用基質輔助激光解離飛行時間質譜(MALDI-TOF)進行蛋白鑒定。也有人利用一維電泳對富集后的尿蛋白進行分離，然后切成10-30個條帶進行膠內酶切，之后利用液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)分別對每個條帶的酶切產物進行分析。也有人對上述尿蛋白制備方法進行組合使用分成更多組分，然后利用LC-MS/MS進行鑒定。

通過這些方法，目前尿蛋白質組的檢測深度可達1500-2300種蛋白質。但目前這些用于尿蛋白質組檢測的工作流程都存在著樣品制備流程繁瑣，質譜檢測時間過長的缺點。樣品制備的每一步都會引入誤差及蛋白損失，因此流程繁瑣除費時外還會導致定量不準確及可重復性差；根據幾個已報道的深度尿蛋白質組研究，為達到1500-2300的蛋白質組檢測深度，每個樣品需要24-48小時的質譜檢測時間。這些低通量的檢測方法應用于從尿蛋白質組中尋找新生物標志物時有很大的局限性。因為通量低，在發現階段所能檢測的樣品數量很有限，通常對照組和疾病組分別只能包括10例左右樣品，這些有限的樣品很難覆蓋尿蛋白質組固有的較大的生理性波動及個體間差異。因此在有限樣品數量的情況下，很難找到能真正反映對照和疾病狀態差異的標志性蛋白。這是當前臨床尿蛋白質組研究中普遍存在的問題，發現階段找到的差異蛋白無法通過后面大樣本量的驗證研究，因此到目前為止還沒有新的尿蛋白標志物通過FDA認證用于臨床。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，為了解決定量深度尿蛋白質組檢測的低通量問題，本發明人對基于離心技術的尿蛋白制備方法進行了系統性改進，形成了一種可用于高通量定量深度尿蛋白質組檢測的樣品制備方法。此外，我們也提出了一種基于硅藻土親和富集的尿蛋白制備技術也可用于高通量定量深度尿蛋白質組檢測。

本發明的一個目的是提供一種尿蛋白制備方法，本發明方法提高了尿蛋白質組檢測的準確性和重復性，并且可用于高通量定量深度尿蛋白質組檢測。

本發明一方面，提供了一種尿蛋白制備方法，包括下面步驟：

(1)將尿液樣品在常溫下超速離心一段時間，棄去上清液，保留沉淀；

(2)向步驟(1)所述的沉淀中加入適量的重懸緩沖液使沉淀重懸；