[發明專利]一種尿蛋白制備方法及尿蛋白質組的檢測方法

在審

• 申請號: 201710048099.6
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108333263A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 秦鈞;冷文川;倪曉天;路天元;甄蓓;王廣舜;孫長青;鐘博文
• 申請（專利權）人: 北京蛋白質組研究中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京驥馳知識產權代理有限公司 11422
• 代理人: 唐曉峰

1.一種尿蛋白制備方法，包括下面步驟：

(1)將尿液樣品在常溫下超速離心一段時間，棄去上清液，保留沉淀；

(2)向步驟(1)所述的沉淀中加入適量的重懸緩沖液使沉淀重懸；

(3)向步驟(2)所得的重懸液中加入能打開二硫鍵的還原劑，于37-80℃溫度下加熱10-60分鐘；

(4)向步驟(3)所得的溶液中添加清洗緩沖液，然后高速離心一段時間，棄去上清，保留沉淀；

(5)用消化緩沖液重新溶解步驟(4)所得的沉淀，之后進行蛋白的溶液內酶解，或用一維電泳(SDS-PAGE)進行蛋白分離。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步驟(1)中，所述尿液樣品的量為100微升(ul)至50毫升(ml)，優選地1ml-10ml；超速離心的離心力為100000-300000g，優選地200000g；所述的常溫為4-25℃，典型地20℃；和/或所述時間為20-120分鐘，更優選地60-80分鐘，最優選75分鐘；

所述步驟(2)中，所述重懸緩沖液為50mM Tris，250mM蔗糖，pH8.5；加入重懸緩沖液后在室溫靜置約5-60分鐘，然后充分吹打重懸沉淀；

所述步驟(3)中，所述還原劑為二硫蘇糖醇或β巰基乙醇；

所述步驟(4)中，所述清洗緩沖液為10mM三乙醇胺，100mM氯化鈉，pH7.4)，超速離心的條件同上述步驟(1)中的條件；

和/或

所述步驟(5)中，所述消化緩沖液為50mM碳酸氫銨緩沖液(50mM NH₄HCO₃，pH8.5)。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述溫度為60-70℃，優選65℃。

4.一種富集尿蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)向尿液中加入適量硅藻土或含硅藻土成分的固體，搖勻；

(2)于37-100℃的溫度下加熱上述步驟(1)中得到的混合物，然后冷卻至常溫，例如4-25℃；

(3)常溫如4-25℃旋轉混合，離心，棄上清；

(4)加入消化緩沖液，進行富集尿蛋白的溶液內酶切；

優選地，

(1)向1毫升尿液中加入10毫克硅藻土或含硅藻土成分的固體，搖勻；

(2)37-100℃加熱5分鐘，冷卻至常溫；

(3)室溫旋轉混合30分鐘，12000rpm離心5分鐘，棄上清；

(4)加30-100微升的消化緩沖液，進行富集尿蛋白的溶液內酶切。

5.一種尿蛋白質組的檢測方法，包括尿蛋白的制備、在蛋白或肽水平的分離、質譜鑒定，其特征在于，所述尿蛋白按照權利要求1-4任一項所述的方法制備。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述分離為電泳分離；優選地，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述分離為蛋白的溶液內酶解；優選地，酶解前用消化緩沖液重溶。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述質譜鑒定為液相色譜-質譜聯用鑒定。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述質譜鑒定為液相色譜二級質譜聯用鑒定。

10.根據權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為：

重懸緩沖液：包括濃度在10-100mM能提供緩沖范圍在pH7.0-8.5的任何緩沖鹽溶液(如Tris或磷酸鹽緩沖液等)以及50-500mM的蔗糖、葡聚糖或海藻糖等能提供合適滲透壓的物質；在典型應用中，重懸緩沖液的成分為50mM Tris，250mM蔗糖，pH8.5；

清洗緩沖液：包括濃度在10-100mM能提供緩沖范圍在pH6.5-8.0的任何緩沖鹽溶液(如Tris或三乙醇胺緩沖液等)以及50-300mM的鹽溶液；在典型應用中，清洗緩沖液的成分為10mM三乙醇胺和100mM氯化鈉，pH8.5；

消化緩沖液：包括濃度在10-100mM能提供緩沖范圍在pH8.0-8.5的碳酸氫銨或Tris緩沖液，含或不含去污劑(如10-100mM的Tris或碳酸氫銨，含或不含0.1-2％的脫氧膽酸鈉)。