[發(fā)明專利]一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710047905.8
• 申請(qǐng)日: 2017-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN106754888B
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱丹;程凡升
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 37252 青島智地領(lǐng)創(chuàng)專利代理有限公司
• 代理人: 申傳曉<國際申請(qǐng)>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明提供的一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒，其包括：(1)魚樣品取樣及魚體表微生物固定處理；(2)腸道微生物的獲取及菌體的收集；(3)細(xì)胞的包埋與裂解；(4)DNA的提取；(5)DNA保存。試劑盒主要成分：溶液A：為Tris、EDTA的混合溶液；B為Tris、EDTA、NaCl、PVP、異硫氰酸胍、Triton?X100、PMSF、β?巰基乙醇的混合溶液；C為Tris、EDTA、NaCl和DTT的混合溶液；溶液D為蛋白酶K、溶菌酶、Tris、NaCl、SDS的混合溶液；E為Tris飽和酚和氯仿混合液；F為異丙醇；G為乙醇水溶液。本發(fā)明得到的DNA片段純度高，宿主及宿主體表微生物DNA含量少。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DAN提取領(lǐng)域，尤其涉及一種魚腸道微生物宏基因組文庫構(gòu)建總DNA的提取方法及試劑盒。

背景技術(shù)

目前傳統(tǒng)的微生物研究手段只能培養(yǎng)0.1％～1％的環(huán)境微生物，這將無法整體分析和利用微生物群落的構(gòu)成和功能。宏基因組文庫技術(shù)可以避開對(duì)微生物純培養(yǎng)的限制，直接從環(huán)境中獲得DNA分子，通過測序或者文庫篩選，為人類進(jìn)一步利用微生物資源提供了重要手段。DNA的提取與純化是宏基因組文庫構(gòu)建的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。

魚腸道微生物具有非常重要的研究價(jià)值，可以用于研究魚類健康和營養(yǎng)代謝、獲得新型酶制劑等。常規(guī)DNA提取主要參照糞便DNA提取法。但是由于在文庫構(gòu)建過程中獲得高純度和高質(zhì)量的DNA，應(yīng)盡量避免魚類體表微生物、魚類腸道組織和食物的污染，同時(shí)還要避免魚類消化道消化液對(duì)DNA的降解。因而，常規(guī)DNA提取方法滿足不了魚腸道微生物宏基因組文庫構(gòu)建的要求。所以，現(xiàn)有技術(shù)有待于更進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供的一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒，在節(jié)約成本的前提下，提取高純度DNA。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明方案包括：

一種用于魚腸道微生物宏基因組總DNA提取方法的試劑盒，其包括：

溶液A：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，pH 8.0；

溶液B：100mM/L Tris-HCl，20mM/L EDTA,100mM/L NaCl，0.1g/L PVP，100mM/L異硫氰酸胍，0.1％Triton-X100，0.1mM PMSF，1％(v/v)β-巰基乙醇，pH 8.5；

溶液C：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，0.9％NaCl，5mM/L DTT，pH 8.0；

溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/L Tris-HCl，100mM/L NaCl，0.1％SDS，pH 8.0；

溶液E：50％Tris-HCl飽和酚(pH 8.0),48％氯仿,2％異戊醇；

溶液F：96％氯仿,4％異戊醇；

溶液G：異丙醇；

溶液H：70％乙醇。

使用所述試劑盒之魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法，其包括以下步驟：

步驟一，將新鮮的樣品魚擊昏，用吸水紙吸干樣品魚體表液體，用75％的酒精擦拭樣品魚體表面，置于-20℃冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍15-30分鐘；

步驟二，使用溶液A配制瓊脂糖凝膠溶液，在保溫箱內(nèi)使其平衡到65℃；

步驟三，迅速取出上述步驟一得到的樣品魚，使用步驟二得到的瓊脂糖凝膠溶液涂漬樣品魚體表，對(duì)樣品魚體表微生物進(jìn)行固定；冷卻后使用滅菌手術(shù)剪迅速對(duì)魚體進(jìn)行解剖，分離得到魚腸道；