[發明專利]一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201710047905.8
• 申請日: 2017-01-21
• 公開（公告）號: CN106754888B
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發明（設計）人: 朱丹;程凡升
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 37252 青島智地領創專利代理有限公司
• 代理人: 申傳曉<國際申請>=<國際公布>=<進入

1.一種使用試劑盒之魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法，其特征在于，所述的試劑盒包括：

溶液A：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，pH 8.0；

溶液B：100mM/L Tris-HCl，20mM/L EDTA,100mM/L NaCl，0.1g/L PVP，100mM/L異硫氰酸胍，0.1％Triton-X100，0.1mM PMSF，1％(v/v)β-巰基乙醇，pH8.5；

溶液C：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，0.9％NaCl，5mM/L DTT，pH 8.0；

溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/L Tris-HCl，100mM/L NaCl，0.1％SDS，pH 8.0；

溶液E：50％Tris-HCl飽和酚(pH 8.0),48％氯仿,2％異戊醇；

溶液F：96％氯仿,4％異戊醇；

溶液G：異丙醇；

溶液H：70％乙醇；

所述的提取方法依次包括以下步驟：

步驟一，將新鮮的樣品魚擊昏，用吸水紙吸干樣品魚體表液體，用75％的酒精擦拭樣品魚體表面，置于-20℃冰箱內進行冷凍15-30分鐘；

步驟二，使用溶液A配制瓊脂糖凝膠溶液，在保溫箱內使其平衡到65℃；

步驟三，迅速取出上述步驟一得到的樣品魚，使用步驟二得到的瓊脂糖凝膠溶液涂漬樣品魚體表，對樣品魚體表微生物進行固定；冷卻后使用滅菌手術剪迅速對魚體進行解剖，分離得到魚腸道；

步驟四，使用無菌過濾器吸取對應量的溶液B緩慢注入上述步驟三得到的魚腸道，重復洗脫3次，將沖洗得到的魚腸道內容物收集得到魚腸道內容物溶液；

步驟五，將上述步驟四得到的魚腸道內容物溶液置于三角瓶中，加入玻璃珠漩渦震蕩10-15分鐘，得到懸濁液；

步驟六，將8層80目尼龍網紗置于布氏漏斗上，抽濾上述步驟五得到的懸濁液，使用對應量的溶液B清洗沉淀物，并收集濾液；

步驟七，將步驟六所得的濾液在10000rpm條件下離心10分鐘并收集沉淀，然后用溶液C重懸沉淀，重復3次，得到下菌體沉淀備用；

步驟八，使用溶液A配置濃度為1％的低熔點瓊脂糖凝膠，平衡其溫度到45℃；將步驟七得到的菌體沉淀預熱到45℃后，向其中加入該1％的低熔點瓊脂糖凝膠，混合均勻后注入模具，并在4℃下凝固12小時，得到凝膠；

步驟九，將步驟八得到的凝膠浸入溶液D中，37℃下恒溫震蕩清洗12小時；

步驟十，將清洗后的凝膠放入低熔點瓊脂糖電泳槽中，使用1％的低熔點瓊脂糖凝膠進行封閉，在60v條件下電泳10分鐘，并在紫外燈下迅速切下瓊脂，得到瓊脂糖凝膠；

步驟十一，將步驟十切下的瓊脂糖凝膠加入等體積的溶液A后，加熱到65℃融化，并立即加入等體積溶液E，搖晃混勻，在12000rpm條件下離心5分鐘，得到水相；

步驟十二，將步驟十一得到的水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入相同體積的溶液F，在12000rpm條件下離心5分鐘，得到相應水相，

步驟十三，將步驟十二得到的相應水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入2倍體積預冷溶液G，在-80℃條件下靜置沉淀12小時，然后在進行10000rpm條件下離心10分鐘；然后向其中加入少量的溶液H重復洗滌2次，得到DNA沉淀；

步驟十四，將步驟十三得到的DNA沉淀在室溫下進行干燥，去除酒精對實驗結果的影響，然后加入相應量的溶液A溶解得到相應DNA。