[發(fā)明專利]高靈敏度基因突變檢測(cè)方法及所用試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710047720.7
• 申請(qǐng)日: 2017-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN106755489A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱成鋼;謝君;王英杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州金溪生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于臨床分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種點(diǎn)突變檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(簡(jiǎn)稱為SNP)是個(gè)體中最常見的遺傳變異類型，占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP研究已成為現(xiàn)在最熱門的課題，可以進(jìn)行性狀基因的精細(xì)定位、分子輔助育種、種子資源鑒定等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，SNP與癌癥易感性以及個(gè)體化治療的關(guān)系愈發(fā)受到關(guān)注。

眾所周知，疾病的部分風(fēng)險(xiǎn)為遺傳，而SNP可能與個(gè)體的癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。近年來，關(guān)于SNP與常見癌癥易感性關(guān)系的研究層出不窮。例如：BRCA1和BRCA2基因突變與女性罹患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)休戚相關(guān)；TGFB1-509C/T多態(tài)性可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控改變從而影響TGFB1基因相關(guān)疾病，如結(jié)直腸癌的發(fā)展和嚴(yán)重程度；另外，XRCC3基因第7個(gè)外顯子中的18067位核苷酸處C到T的替換與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系也有大量報(bào)道。

除此之外，近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，同一種藥物對(duì)不同病人的治療效果有時(shí)差異顯著。此類差異大多是由于藥物在不同的個(gè)體內(nèi)活化、代謝和清除等方面的基因差異所決定的，而這種基因差異主要是SNP。研究SNP與藥物的個(gè)體敏感性或耐受性之間的關(guān)聯(lián)，可以闡明與藥物治療以及毒副作用相關(guān)的SNP基因型，從而為針對(duì)性地使用藥物提供依據(jù)。比如，歐洲藥監(jiān)局和美國FDA明確規(guī)定在使用靶向藥物愛必妥(Erbitux)和維克替比(Vectibix)治療轉(zhuǎn)移性大腸癌前必須檢測(cè)K-ras基因；另外，進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)用于指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者EGFR-TKIs治療已在全球形成共識(shí)，成為標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)踐。

因此，人們期待準(zhǔn)確且短時(shí)間、低成本地測(cè)定基因突變或進(jìn)行基因分型的方法，通過該類檢測(cè)預(yù)測(cè)各類疾病發(fā)生頻率和/或耐藥性。

目前，針對(duì)基因突變的檢測(cè)方法主要有測(cè)序法、高分辨率熔解曲線法、探針熒光定量法。但是，上述方法均存在著一定的缺陷。例如：測(cè)序法靈敏度低，一般需要基因豐度達(dá)到10％以上才能準(zhǔn)確檢測(cè)；高分辨率熔解曲線法對(duì)熒光定量?jī)x器的要求較高；探針熒光定量法探針合成的成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度基因點(diǎn)突變檢測(cè)方法及所用試劑盒，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)周期長、靈敏度低且檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒，包括：PCR緩沖液、無外切酶活性的DNA聚合酶、一條LNA修飾的類ARMS引物、一條常規(guī)引物(常規(guī)的無修飾引物)、dNTP混合液、核酸染料和參比染料。

作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的改進(jìn)：所述無外切酶活性的DNA聚合酶，既無3’-5’外切酶活性，亦無5’-3’外切酶活性。

備注：一般PCR反應(yīng)所用的為具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。

作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：所述無外切酶活性的DNA聚合酶為Platinum GenoType Tsp DNA Polymerase(Invitrogen，美國)。

作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述LNA修飾的類ARMS引物3’末端是核酸類似物，核酸類似物的碳環(huán)2’氧原子和4’碳原子位置引入亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，因此LNA化學(xué)極大地增強(qiáng)了寡核苷酸的識(shí)別能力。

作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：

LNA修飾的類ARMS引物，其3’端的一個(gè)堿基進(jìn)行鎖核酸修飾，引物序列與突變型序列互補(bǔ)，3’末端與野生型序列有一個(gè)堿基的差異。

作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：

針對(duì)野生型/突變型MINA(突變類型C/T)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:1；常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:2；

針對(duì)野生型/突變型B-raf(突變類型T/A)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:4，常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:5；

針對(duì)野生型/突變型K-ras(突變類型G/A)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:6，常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:7；

針對(duì)野生型/突變型EGFR(突變類型G/C)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:8，常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:9；

針對(duì)野生型/突變型EGFR(突變類型G/A)，LNA修飾的類ARMS引物為SEQ ID NO:10，常規(guī)引物為SEQ ID NO:11。