[發(fā)明專利]高靈敏度基因突變檢測方法及所用試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710047720.7
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN106755489A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱成鋼;謝君;王英杰
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州金溪生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司33212
• 代理人: 金祺

1.高靈敏度基因突變檢測試劑盒，其特征在于包括：PCR緩沖液、無外切酶活性的DNA聚合酶、一條LNA修飾的類ARMS引物、一條常規(guī)引物、dNTP混合液、核酸染料和參比染料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏度基因突變檢測試劑盒，其特征在于：所述無外切酶活性的DNA聚合酶，既無3’-5’外切酶活性，亦無5’-3’外切酶活性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高靈敏度基因突變檢測試劑盒，其特征在于：所述無外切酶活性的DNA聚合酶為Platinum GenoType Tsp DNA Polymerase。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏度基因突變檢測試劑盒，其特征在于：

所述LNA修飾的類ARMS引物3’末端是核酸類似物，核酸類似物的碳環(huán)2’氧原子和4’碳原子位置引入亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，因此LNA化學(xué)極大地增強了寡核苷酸的識別能力。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高靈敏度基因突變檢測試劑盒，其特征在于：

LNA修飾的類ARMS引物，其3’端的一個堿基進行鎖核酸修飾，引物序列與突變型序列互補，3’末端與野生型序列有一個堿基的差異。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一所述的高靈敏度基因突變檢測試劑盒，其特征在于：

針對野生型/突變型MINA，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:1；常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:2；

針對野生型/突變型B-raf，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:4，常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:5；

針對野生型/突變型K-ras，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:6，常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:7；

針對野生型/突變型EGFR，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQ ID NO:8，常規(guī)引物序列為SEQ ID NO:9；

針對野生型/突變型EGFR，LNA修飾的類ARMS引物為SEQ ID NO:10，常規(guī)引物為SEQ ID NO:11。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一所述的高靈敏度基因突變檢測試劑盒，其特征在于：

所述dNTP混合液濃度為2.5mM，包含等量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP；

所述核酸染料為SYBR Green I；

所述參比染料為ROX。

8.利用如權(quán)利要求1～7任一所述的試劑盒進行的高靈敏度基因突變檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

在檢測管中加入PCR緩沖液、無外切酶活性的DNA聚合酶、LNA修飾的類ARMS引物、常規(guī)引物、dNTP混合液、核酸染料、參比染料，以及加入待測樣品，從而組成PCR反應(yīng)體系，然后進行PCR反應(yīng)；

當(dāng)PCR反應(yīng)的結(jié)果有擴增曲線時，判定待測樣品屬于突變樣品；

反之，當(dāng)PCR反應(yīng)的結(jié)果無擴增曲線時，判定待測樣品屬于野生型樣品。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高靈敏度基因突變檢測方法，其特征在于：

25μl的PCR反應(yīng)體系為：

10×PCR緩沖液：2.5μl

LNA修飾的類ARMS引物(10μM)：0.5μl

常規(guī)引物(10μM)：0.5μl

無外切酶活性的DNA聚合酶：1U

dNTP(2.5mM)：1.5μl

SYBR Green I(20×)：1μl

參比染料ROX(25μM)：0.5μl

待測樣品：1.5ng

加水補足至25μl。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的高靈敏度基因突變檢測方法，其特征在于：

PCR反應(yīng)條件為：95℃2分鐘，1個循環(huán)；95℃15秒，60℃1秒，35個循環(huán)。