[發明專利]一種對蝦養殖中嗜水氣單胞菌的Lamp檢測方法

在審

• 申請號: 201710046232.4
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106755487A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 王文琪;徐申波;任貽超;王鑫;張艷
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及的是嗜水氣單胞菌的技術領域，具體的說是一種對蝦養殖中嗜水氣單胞菌的Lamp檢測方法。

背景技術

在對蝦的流行病學研究基礎上，確立出白斑綜合癥病毒(WSSV)、弧菌和嗜水氣單胞菌是山東省蝦蟹養殖的重要病原，如何快速的檢測出對蝦中的嗜水氣單胞菌是至關重要的。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的缺陷和不足，提供了一種嗜水氣單胞菌的Lamp檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種對蝦養殖中嗜水氣單胞菌的Lamp檢測方法，其步驟是：

1、嗜水氣單包菌菌種的培養；

2、嗜水氣單胞菌染色體DNA的提取；

3、引物的設計；

4、提模板；

5、LAMP反應體系的建立。

進一步，所述嗜水氣單包菌菌種的培養方法是：(1)、取保藏的嗜水氣單胞菌在營養肉汁瓊脂平板培養基中進行平板劃線分離單菌落，放入恒溫箱28～30℃倒置培養24h；(2)挑取單菌落接種至3ml的液體培養基(試管)中，放入28～30℃100r/min搖床培養12h；(3)將試管中培養的菌轉接入120ml的液體培養基中相同條件下培養12h，4℃下保存備用。

進一步，所述嗜水氣單胞菌染色體DNA的提取方法是：移液槍取一嗜水氣單胞菌菌落,接種于營養肉湯,于28℃培養18～24h。

進一步，所述提模板的方法是：取1ml嗜水氣單胞菌染色體DNA培養液于離心管中，12000r/min離心5min，去掉上清液然后加入100ul無菌水混合，100℃水浴加熱10min，冰浴2min，12000r/min離心5min，保留上清液備用。

進一步，所述LAMP反應體系的建立包括溫度實驗、時間實驗、對照實驗、敏感性實驗、特異性實驗。

本發明的有益效果為：檢測速度塊，檢測準確，有效診斷對蝦中的致病細菌，提前做好針對性的準備，防止對蝦感染，從而預防對蝦病害的發生。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合具體實施方式，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施方式僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

一種對蝦養殖中嗜水氣單胞菌的Lamp檢測方法，其步驟如下：

1、嗜水氣單包菌菌種的培養：

(1)取保藏的從養殖對蝦體內分離的嗜水氣單胞菌，在營養肉汁瓊脂平板培養基中進行平板劃線分離單菌落，放入恒溫箱28～30℃倒置培養24h。

(2)挑取單菌落接種至3ml的液體培養基(試管)中，放入28～30℃100r/min搖床培養12h。

(3)將試管中培養的菌轉接入120ml的液體培養基中相同條件下培養12h，4℃下保存備用。

2、嗜水氣單胞菌染色體DNA的提取：

移液槍取一嗜水氣單胞菌菌落,接種于營養肉湯,于28℃培養18～24h。

3、引物的設計：

基于A.hy drophila的Aer基因序列及其相似性比對,設計了4條特異性引物,即F3、B3、FIP和BIP,其序列依次為:

F3:5′-CGGTAAAGCCCTGGACTCT-3′；

B3:5′-CCGCCTTTGTGTCATATCGA-3′；

FIP:5′-GATCAGGATGCCGACACCGAC-GCCCAGTCAGACGTCACT-3′；

BIP:5′-ATGTCTTTGCTCATCGGGACGC-AACGATGCCCTGTAGCCTT-3′。

4、提模板：

取1ml1.2.2培養液于離心管中，12000r/min離心5min。去掉上清液然后加入100ul無菌水混合，100℃水浴加熱10min，冰浴2min，12000r/min離心5min，保留上清液備用。

5、LAMP反應體系的建立

(1)、溫度實驗

取5個PCR管，分別標號1～5。在這五個管中，分別加入表2所示試劑。接著在T100^TMThermal Cycler上分別設置溫度為61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，時間均為90min擴增。擴增完后在電泳儀上電泳，最后在凝膠成像分析儀上得到結果。

表2 LAMP反應體系