[發明專利]同時檢測葡萄潰瘍病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其應用

有效

• 申請號: 201710045658.8
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN106701968B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 張瑋;李興紅;燕繼曄;劉梅;周瑩;邢啟凱;盧蝶
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳;趙靜

1.一組檢測葡萄潰瘍病菌和葡萄蔓枯病菌的雙重PCR引物組，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸組成。

2.根據權利要求1所述的檢測葡萄潰瘍病菌和葡萄蔓枯病菌的雙重PCR引物組，其特征在于：所述葡萄潰瘍病菌為小新殼梭孢(Neofusicoccum parvum)、可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)和/或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，所述葡萄蔓枯病菌為Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和/或Diaporthesojae。

3.一種同時檢測葡萄潰瘍病菌和葡萄蔓枯病菌的試劑盒，包括權利要求1或2所述的雙重PCR引物組。

4.根據權利要求3所示的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還包括PCR反應試劑。

5.權利要求1或2所述的雙重PCR引物組以及權利要求3或4所述的試劑盒在檢測葡萄潰瘍病菌和葡萄蔓枯病菌中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述葡萄潰瘍病菌為小新殼梭孢、可可毛色二孢和/或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，所述葡萄蔓枯病菌為Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和/或Diaporthesojae。

7.同時檢測葡萄潰瘍病菌和葡萄蔓枯病菌的雙重PCR方法，包括下述步驟：

1)提取待測樣品DNA；

2)以待測樣品DNA為模板，用權利要求1所述的雙重PCR引物組進行雙重PCR擴增；

3)鑒定步驟2)所述的PCR擴增產物的大小，將擴增產物中含有一個219bp的DNA特異性擴增片段的待測樣品鑒定為含有葡萄潰瘍病菌的樣品，將擴增產物中含有一個365bp的DNA特異性擴增片段的待測樣品鑒定為含有葡萄蔓枯病菌的樣品。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中，所述葡萄潰瘍病菌為小新殼梭孢、可可毛色二孢和/或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，所述葡萄蔓枯病菌為Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和/或Diaporthesojae。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述雙重PCR擴增的反應體系為25μL，包括：待測樣品DNA 0.01-0.8ng/μL，序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸終濃度分別為0.2μmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的終濃度分別為2.5mmol/L，2.5μL 10×PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶終濃度為0.05U/μl，其余部分用ddH₂O補足；其中，10×PCR緩沖液是由100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl₂組成的溶液。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：雙重PCR反應條件為：94℃預變性3min；35個循環的95℃30s，56℃30s和72℃15s；72℃延伸5min。