[發明專利]一種沉默T細胞抗原受體的T淋巴細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201710045150.8
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN107058230B
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 劉明錄;金海峰;強邦明;萬磊;韓慶梅;馮建海;張傳鵬;馬洪華
• 申請（專利權）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/867;C12N15/113;A61K48/00;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 楊筠

本發明公開了一種沉默T細胞抗原受體的T細胞制備方法，本發明是一種RNA干擾技術，特別是雙靶點干擾技術沉默T細胞抗原受體，本發明還涉及表達shRNA的T細胞，所述T細胞可沉默自身的T細胞抗原受體，對異體來源的組織降低排斥作用。

技術領域

本發明涉及生物與新醫藥技術領域，更具體的說，是一種沉默T細胞抗原受體的T淋巴細胞的制備方法。

背景技術

T淋巴細胞是在胸腺中分化成熟的淋巴細胞，故稱胸腺依賴性淋巴細胞(Thymus-dependent lymphocyte)，簡稱T細胞。T細胞是由胸腺內的淋巴干細胞分化而成，是淋巴細胞中數量最多，功能最復雜的一類細胞。T細胞膜表面分子與T細胞的功能相關，也是T細胞的表面標志，可以用以分離、鑒定不同亞群的T細胞。TCR為所有T細胞表面的特征性標志，以非共價鍵與CD3結合，形成TCR-CD3復合物。TCR的作用是識別抗原。TCR是由兩條不同肽鏈構成的異二聚體，由α、β兩條肽鏈組成，每條肽鏈又可分為胞外區、跨膜區和胞質區等幾部分；其特點是胞質區很短。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于胞外區。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默，是一種特異性的轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgenesilencing)。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾，可以特異地將特定的基因沉默，從而獲得基因功能喪失或基因表達量的降低，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。RNAi技術可廣泛應用到包括功能學，藥物靶點篩選，細胞信號傳導通路分析，疾病治療等等。

機體對內外的各種致病因子有著非常完善的防御機制，其中對外來物如細菌、病毒、異物等“異己成分”的重要作用，就是攻擊、破壞、清除。這主要是由于T細胞抗原受體的識別作用。每個機體內的T細胞抗原受體都是特異的，遇到來源于異體的T細胞時會發生免疫反應。而在細胞免疫治療技術的應用中，當病人因身體虛弱，導致自體外周血中T細胞數量比較少，很難在體外誘導成CIK細胞，因此，應用異體T細胞對病人免疫治療具有潛在優勢。

發明內容

為了彌補以上不足，本發明提供了一種沉默T細胞抗原受體的T淋巴細胞的制備方法，本發明為一個雙靶點的RNA干擾技術，表達所述雙靶點RNAi的T淋巴細胞，以及所述T淋巴細胞用于異體回輸降低排斥反應的用途。

本發明的方案是：

一種沉默T細胞抗原受體的T細胞制備方法，在TCR的α鏈和β鏈基因中分別選取連續的21個核苷酸，并與相應的啟動子序列依次連接起來，得到轉錄形成TCR-RNAi的融合基因片段，將所構建的融合基因片段插入慢病毒表達載體，包裝成攜帶TCR-RNAi融合基因的慢病毒，將所述攜帶TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染單核細胞誘導的異質T淋巴細胞，得到沉默T細胞抗原受體的T淋巴細胞。

作為優選的技術方案，所述的轉錄TCR-RNAi的融合基因片段為序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

作為優選的技術方案，所述單核細胞誘導的異質T淋巴細胞如下制備：取臍帶血，分離單核細胞，用含有重組干擾素的培養基誘導培養24小時后，加入重組白細胞介素、OKT-3和5％的患者自體血漿誘導繼續培養24小時；每隔三天倍比加液，培養至第17天，流式細胞術檢測CIK細胞的分子標記TCR+的陽性表達率；當TCR+陽性率>90％，收獲由單核細胞誘導的異質T淋巴細胞。