[發(fā)明專利]一種沉默T細(xì)胞抗原受體的T淋巴細(xì)胞的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710045150.8
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN107058230B
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉明錄;金海峰;強(qiáng)邦明;萬磊;韓慶梅;馮建海;張傳鵬;馬洪華
• 申請（專利權(quán)）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/867;C12N15/113;A61K48/00;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 楊筠

1.一種沉默T細(xì)胞抗原受體的T細(xì)胞制備方法，其特征在于：在TCR的α鏈和β鏈基因中分別選取連續(xù)的21個核苷酸，并與相應(yīng)的啟動子序列依次連接起來，得到轉(zhuǎn)錄形成TCR-RNAi的融合基因片段，將所構(gòu)建的融合基因片段插入慢病毒表達(dá)載體，包裝成攜帶TCR-RNAi融合基因的慢病毒，將所述攜帶TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)T淋巴細(xì)胞，得到沉默T細(xì)胞抗原受體的T淋巴細(xì)胞；所述的轉(zhuǎn)錄TCR-RNAi的融合基因片段為序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

2.如權(quán)利要求1所述的一種沉默T細(xì)胞抗原受體的T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)T淋巴細(xì)胞如下制備：取臍帶血，分離單核細(xì)胞，用含有重組干擾素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后，加入重組白細(xì)胞介素、OKT-3和5％的患者自體血漿誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)24小時；每隔三天倍比加液，培養(yǎng)至第17天，流式細(xì)胞術(shù)檢測CIK細(xì)胞的分子標(biāo)記TCR+的陽性表達(dá)率；當(dāng)TCR+陽性率>90％，收獲由單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)T淋巴細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1所述的一種沉默T細(xì)胞抗原受體的T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，將所述攜帶TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)T淋巴細(xì)胞如下制備：所述攜帶TCR-RNAi融合基因的慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，所述293T細(xì)胞釋放慢病毒顆粒，所述慢病毒顆粒感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)T淋巴細(xì)胞。

4.如權(quán)利要求1所述的一種沉默T細(xì)胞抗原受體的T淋巴細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄TCR-RNAi融合基因片段如下制?。和ㄟ^基因合成技術(shù)將選取的TCR中的α鏈和β鏈的21個核苷酸，H1啟動子，U6啟動子與酶切位點的核苷酸序列構(gòu)成融合基因TCR-RNAi。

5.一種治療腫瘤可以異體回輸?shù)乃幬铮涮卣髟谟冢汉袡?quán)利要求1所述的沉默T細(xì)胞抗原受體的T細(xì)胞。