[發明專利]非糖基化蛋白質的純化

在審

• 申請號: 201710044891.4
• 申請日: 2009-01-15
• 公開（公告）號: CN107033233A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: R·法爾肯施泰因;B·魏丹茲;C·吉賽爾;S·格賴塔納;A·格羅斯曼;F·赫西;B·克雷默;M·蓬皮阿蒂;A·肖布馬爾;N·菲爾勒
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C07K1/18
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所11247
• 代理人: 柴云峰,黃革生

本申請是申請日為2009年1月15日、發明名稱為“非糖基化蛋白質的純化”的中國專利申請200980102331.3(國際申請號PCT/EP2009/000192)的分案申請。

發明領域

本發明涉及多肽純化的領域。報道了利用三個層析步驟的組合純化非糖基化多肽的一般方法。

發明背景

蛋白質在今天的醫藥領域中起重要作用。對于人類應用，每一藥學物質必須滿足不同的標準。為了保證生物藥劑對人類的安全性，必須特異性地去除可能引起嚴重危害的核酸、病毒和宿主細胞蛋白質。為了滿足管理規定，制造方法后必須進行一個或更多純化步驟。其中，純度、通量和產量在決定適當的純化方法中起重要作用。

很好地建立了不同方法，并且所述方法廣泛用于蛋白質純化，如使用親硫配體、Cu-螯合物或微生物蛋白質的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如陽離子交換層析、陰離子交換層析和混合模式層析)、親硫吸附、疏水相互作用或芳香族吸附層析、大小排阻層析和電泳方法(如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

例如可通過原核細胞如大腸桿菌(E.coli.)產生重組多肽。重組產生的多肽占原核細胞多肽含量的大多數并且在原核細胞中經常沉積為不可溶的聚集物，即沉積為所謂的包含體。為了分離重組多肽，必須崩解細胞并從細胞碎片中分離所述包含體后將該包含體中所含的重組多肽溶解。對于增溶離液劑，使用如尿素或鹽酸胍。尤其是在堿性條件下，為了切割二硫鍵，加入還原劑，如二硫赤蘚糖醇、二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇。在將聚集的多肽溶解后，必須重新建立生物活性必需的重組多肽的球形結構。在這個所謂的復性過程中，例如通過針對合適的緩沖液進行透析來緩慢降低變性劑的濃度，其允許變性的多肽重新折疊成生物活性結構。復性后是重組多肽純化到預期使用的可接受純度。例如，為了用作治療蛋白，必須建立高于90％的純度。從大腸桿菌中獲得的重組產生的多肽一般伴隨有核酸、內毒素、來自生產細胞的多肽和非復性的重組多肽。

在可獲得許多不同層析方法的情況下，必須測試許多組合以尋找合適的純化方法。在這些組合中，可使用不用的順序，甚至不同數量的層析方法。因此，期望擁有確定層析步驟的合適順序用以純化非糖基化的多肽的方法。

在WO 2007/075283中報道了靶分子純化的多步驟系統和方法。在WO 2007/016250中報道了用于純化包含目的蛋白的化合物的方法。在WO 2006/101441中報道了僅包括一個或很少程序步驟的純化重組蛋白的方法。Rege等(Rege,K.,Biotechnol.Bioeng.93(2006)618-630)報道了用于重組蛋白質純化的高通量方法開發。在KR 2002/080108中報道了用于從重組大腸桿菌中純化人生長激素的方法。

發明概述

本發明的第一個方面是用于純化已經在原核細胞中重組產生的非糖基化異源多肽的方法，其中所述方法包括以下順序的以下三個層析步驟：

a)選自以下的第一個層析步驟

i)疏水電荷誘導層析,

ii)疏水作用層析,

iii)親和層析，或

iv)離子交換層析，

b)選自以下的第二個層析步驟

i)陰離子交換層析,

ii)陽離子交換層析,

iii)羥基磷灰石層析,

iv)疏水作用層析，或

v)疏水電荷誘導層析,

c)選自以下的第三個層析步驟

i)疏水電荷誘導層析,

ii)陰離子交換層析,

iii)陽離子交換層析，或

iv)疏水作用層析,

由此，

-在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，第一個層析步驟是親和層析，

-在多肽具有低于6.0的等電點的情況下第二個層析步驟不是羥基磷灰石層析步驟，

-在多肽具有低或高等電點的情況下可以以流通模式進行第三個層析步驟，

-任選地第三個層析步驟可用于多肽的濃縮，

并在步驟c)后獲得純化的非糖基化異源多肽。

本發明的方法包括至少三個層析步驟，由此對于每一步驟，可不依賴于為前述步驟或以下步驟所選的層析材料選擇層析材料，由此僅需要考慮所給出的條件。因此，本發明的方法提供了用于純化非糖基化多肽的靈活的和可交換順序的層析步驟，由此在非糖基化多肽經歷本發明方法后獲得的純度同樣獨立于所選層析步驟順序。