[發(fā)明專利]均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710044212.3
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106834458A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張菊;張濰;王曉棟;王金燕;姜英浩;劉文超
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安新思維專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司61114
• 代理人: 李罡

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法。

背景技術(shù)

等位基因變異是細(xì)胞中一對同源染色體雙鏈DNA相同位置上控制某性狀基因的變異。個體基因組中，等位基因變異與野生型同時存在，相互制約平衡，共同影響基因表達(dá)和功能，影響生物反應(yīng)，決定細(xì)胞轉(zhuǎn)歸性質(zhì)等表型；個體內(nèi)等位基因變異存在異質(zhì)性和劑量效應(yīng)，不同個體在不同階段等位基因變異與野生型的相對數(shù)量水平不同，變異相對數(shù)量水平變化直接影響基因功能和表達(dá)。EGFR等位基因19外顯子變異與野生型同時存在，互相影響，共同決定細(xì)胞EGFR靶向藥物反應(yīng)性表型。不同個體EGFR等位基因19外顯子E746-A750的缺失突變含量差異較大，我們將基因組中EGFR等位基因19外顯子變異型與野生型的比例即相對數(shù)量水平命名為EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)，它是個體較EGFR等位基因19外顯子變異型別和絕對數(shù)量與藥物反應(yīng)性更高度相關(guān)、更敏感特異、更科學(xué)準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)量化的的分子標(biāo)識。故個體中EGFR等位基因19外顯子野生型與突變型相對含量：EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)是更全面的EGFR靶向藥藥效預(yù)測指標(biāo)。但目前現(xiàn)有技術(shù)或只檢測EGFR等位基因19外顯子突變或只檢測其絕對量，而未檢測EGFR等位基因19外顯子野生型與突變型的相對含量比例，因檢測對象片面，檢測結(jié)果受取材基因變異異質(zhì)性、取材方法、數(shù)量部位等因素影響，應(yīng)用價值低；或檢測方法繁瑣低效、不標(biāo)準(zhǔn)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種熒光偏振均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，用于EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)即EGFR等位基因19外顯子野生型與突變型含量比值的檢測，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的片面、成本高、操作步驟繁瑣、易污染的問題。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，其特征在于：

所用試劑包括：

MgCl₂，10×PCR反應(yīng)緩沖液，dNTPs，EGFR等位基因19外顯子DNA引物，EGFR等位基因19外顯子E746-A750，2236到2250位堿基的15bp缺失突變DNA的FAM標(biāo)記探針、EGFR等位基因19外顯子E746-A750，2236到2250位堿基的15bp野生型DNA的R110標(biāo)記探針，模板：待檢測樣品DNA，陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品即pGEM-T-easy空載體、陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品即EGFR等位基因19外顯子野生型對照標(biāo)準(zhǔn)品與19外顯子突變型對照標(biāo)準(zhǔn)品的混合物，濃度均為1000拷貝/ml；

對試劑分別進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行FAM和R110熒光偏振值的檢測，陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品FAM和R110熒光偏振值分別大于陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品FAM和R110熒光偏振值30mp以上則為擴(kuò)增成功，根據(jù)待檢測樣品FAM和R110熒光偏振值與陽、陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品的差值高低變化和比值判讀待檢測樣品的EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)。

擴(kuò)增反應(yīng)在25uL體系中進(jìn)行，加入10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，濃度均為2.0mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，DNA聚合酶1-2單位，濃度為1.5-3.0mM MgCL₂。濃度均為0.5uM的EGFR基因19外顯子上游引物和3’端帶熒光標(biāo)記的2種探針,濃度0.1uM-0.05uM的EGFR等位基因19外顯子下游引物；5μL模板DNA；

PCR緩沖液是1.0U Taq polymerase。

據(jù)EGFR等位基因GenBank序列，設(shè)計合成覆含EGFR等位基因19外顯子E746-A750的引物及19外顯子野生型、突變型探針：

EGFR19正向引物5'-gtgcatcgctggtaacatcc-3'；

EGFR19反向引物5'-gaagcaacatctccgaaaagc-3'；

19外顯子野生型探針：5’-gagggaattaagagaagctc–R110 3’；

19外顯子突變型探針：5’-gccaaaacatctccggc-FAM 3’。

擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃變性5min后，95℃孵育1秒，60℃孵育1秒，72℃孵育10秒，45個循環(huán)，最后一個循環(huán)無72℃孵育。