[發(fā)明專利]均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710044212.3
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106834458A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張菊;張濰;王曉棟;王金燕;姜英浩;劉文超
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務(wù)所有限公司61114
• 代理人: 李罡

1.均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，其特征在于：

所用試劑包括：

MgCl₂，10×PCR反應(yīng)緩沖液，dNTPs，EGFR等位基因19外顯子DNA引物，EGFR等位基因19外顯子E746-A750，2236到2250位堿基的15bp缺失突變DNA的FAM標記探針、EGFR等位基因19外顯子E746-A750，2236到2250位堿基的15bp野生型DNA的R110標記探針，模板：待檢測樣品DNA，陰性對照標準品即pGEM-T-easy空載體、陽性對照標準品即EGFR等位基因19外顯子野生型對照標準品與19外顯子突變型對照標準品的混合物，濃度均為1000拷貝/ml；

對試劑分別進行擴增，然后對擴增產(chǎn)物分別進行FAM和R110熒光偏振值的檢測，陽性對照標準品FAM和R110熒光偏振值分別大于陰性對照標準品FAM和R110熒光偏振值30mp以上則為擴增成功，根據(jù)待檢測樣品FAM和R110熒光偏振值與陽、陰性對照標準品的差值高低變化和比值判讀待檢測樣品的EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，其特征在于：

擴增反應(yīng)在25uL體系中進行，加入10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，濃度均為2.0mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，DNA聚合酶1-2單位，濃度為1.5-3.0mM MgCL₂。濃度均為0.5uM的EGFR基因19外顯子上游引物和3’端帶熒光標記的2種探針,濃度0.1uM-0.05uM的EGFR等位基因19外顯子下游引物；5μL模板DNA；

PCR緩沖液是1.0U Taq polymerase。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，其特征在于：

據(jù)EGFR等位基因GenBank序列，設(shè)計合成覆含EGFR等位基因19外顯子E746-A750的引物及19外顯子野生型、突變型探針：

EGFR19正向引物5'-gtgcatcgctggtaacatcc-3'；

EGFR19反向引物5'-gaagcaacatctccgaaaagc-3'；

19外顯子野生型探針：5’-gagggaattaagagaagctc–R110 3’；

19外顯子突變型探針：5’-gccaaaacatctccggc-FAM 3’。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，其特征在于：

擴增反應(yīng)條件為：94℃變性5min后，95℃孵育1秒，60℃孵育1秒，72℃孵育10秒，45個循環(huán)，最后一個循環(huán)無72℃孵育。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，其特征在于：

分別擴增EGFR等位基因19外顯子陰性對照標準品模板即pGEM-T-easy空載體、陽性對照標準品模板即EGFR等位基因19外顯子野生型對照標準品1000拷貝/ml+19外顯子突變型對照標準品1000拷貝/ml、及待測DNA樣品，分別獲得EGFR等位基因19外顯子目的基因擴增產(chǎn)物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的均相檢測EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)的方法，其特征在于：

所述方法分別檢測陰性對照標準品、陽性對照標準品及待測樣品EGFR等位基因19外顯子目的基因的最終擴增產(chǎn)物的FAM和R110熒光偏振值；

陽性對照標準品R110、FAM熒光偏振值分別大于陰性對照標準品R110、FAM熒光偏振值30mp以上則為擴增成功；

待測樣品的EGFR等位基因19外顯子突變指數(shù)＝{〔待測樣品的FAM熒光偏振值-(陽性對照標準品FAM熒光偏振值-陰性對照標準品FAM熒光偏振值)〕/(陽性對照標準品FAM熒光偏振值-陰性對照標準品FAM熒光偏振值)}÷{〔待測樣品的R110熒光偏振值-(陽性對照標準品R110熒光偏振值-陰性對照標準品R110熒光偏振值)〕/(陽性對照標準品R110熒光偏振值-陰性對照標準品R110熒光偏振值)}。