[發明專利]一種骨骼或牙齒DNA磁珠提取方法和試劑

在審

• 申請號: 201710043744.5
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN108330125A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 王升啟;劉琪琦;劉麗艷;張敏麗;周喆;張慶珍;丁曉然;王瓊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，具體流程包括試劑配制和方法操作：

(1)試劑配制：包括脫鈣液、消化液、結合液、洗滌液和洗脫液的配制；

(2)脫鈣液A預處理，將用液氮處理后研磨成粉末的骨骼/牙齒樣本，作為DNA提取樣品。取陳舊骨骼/牙齒檢材粉末樣品置于離心管中，加入預處理液A，對骨骼/牙齒檢材在30-45℃條件下于旋轉混合儀中避光進行脫鈣預處理1.0-2.0小時；

(3)消化液B裂解，在避光45-65℃條件下對樣本進行消化裂解處理釋放DNA；

(4)結合液C結合DNA，避光室溫條件下采用磁珠特異性吸附樣本中的DNA；

(5)洗滌，配置洗滌液W1和W2對吸附DNA的磁珠進行洗滌；

(6)加入洗脫液T，在室溫或高溫作用下輔助洗脫，經過充分混合洗脫后，進行磁珠分離，然后用移液器吸取上清液體，此液體即為提取的骨骼/牙齒檢材DNA，所述的物理強化作用為漩渦震蕩、加熱組合的方式。

2.根據權利要求1所述的一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，其DNA提取試劑配方特征是：

預處理脫鈣液A：0.2-0.8M乙二胺四乙酸(EDTA)；

消化液B：0.3-0.6％(w/v)N-月桂酰肌氨酸鈉鹽(NLS)，0.2-0.5M乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.40-0.70mg/ml蛋白酶K，0.02-0.05M二硫蘇糖醇(DTT)

磁珠懸浮液：15-30％(w/v)納米磁珠；

結合液C：35-50％(v/v)異丙醇，2.0-4.0M鹽酸胍，0.5-1.5mg磁珠；

洗滌液W1：5-10mM氯化鈣，70-90％(v/v)乙醇；

洗滌液W2：70-90％(v/v)乙醇；

洗脫液T：0.5×TE(Tris-EDTA)，pH＝7.0-9.0。

3.根據權利要求1所述的一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，其檢材DNA提取的脫鈣過程特征是：

所提取的骨骼/牙齒檢材粉末(以克為單位)與脫鈣液(以毫升為單位)的比例滿足1:5-1:15，于混懸儀上30-40℃避光處理1.0-2.0小時。

4.根據權利要求1所述的一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，其檢材DNA提取的消化過程特征是：

消化液B的用量(以毫升為單位)是樣本起始量(以克為單位)的4-6倍，每1.0g樣本中蛋白酶K的使用量為250-400ul(20mg/ml)，雙硫蘇糖醇的使用量為400-500ul(1M)，于混懸儀上45-65℃條件下避光處理1.0-2.0小時。

5.根據權利要求1所述的一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，其檢材DNA提取的結合過程特征是：

結合液C的用量與消化離心后的上清液的比例為1:0.8-1:1.5，加入適量70-80％HAC調節PH至4.0-9.0，于混懸儀上室溫避光處理0.5-2.0小時。

6.根據權利要求1所述的一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，其檢材DNA提取的洗滌過程特征是：

洗滌液W1的用量為800ul-1000ul，洗滌液W2的用量為800ul-1000ul，后于eppendorf震蕩孵育器，500-800rpm，敞開管口45-60℃處理5min揮干乙醇。

7.根據權利要求1所述的一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，其檢材DNA提取的洗脫過程特征是：

洗脫液T的用量為25-50μl，以保證洗脫效率，所使用的eppendorf震蕩孵育器條件設置為：1000-1200rpm，50-65℃加熱振蕩5min。

8.根據權利要求1所述的一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，其DNA提取對象特征是：

骨骼和牙齒檢材，特別是陳舊骨骼和牙齒檢材。