[發明專利]一種骨骼或牙齒DNA磁珠提取方法和試劑

在審

• 申請號: 201710043744.5
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN108330125A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 王升啟;劉琪琦;劉麗艷;張敏麗;周喆;張慶珍;丁曉然;王瓊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種骨骼或牙齒DNA磁珠提取方法和試劑。試劑包括：0.2?0.8M EDTA，0.3?0.6％NLS，0.2?0.5M EGTA，0.40?0.70mg/ml PK，0.02?0.05M DTT，35?50％異丙醇，2.0?4.0M鹽酸胍，0.5?1.5mg磁珠，5?10mM氯化鈣，70?90％乙醇，0.5×TE。方法步驟：1.脫鈣：30?45℃處理檢材；2.消化：45?65℃裂解檢材釋放DNA；3.結合：室溫結合DNA；4.洗滌：清洗磁珠；5.洗脫：室溫或高溫振蕩洗脫DNA。該方法能高效地提取骨骼或牙齒DNA，滿足定量定性、測序等實驗及法醫科學DNA分型與應用的要求。

技術領域

本發明涉及一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，特別是針對陳舊檢材，屬于生物技術領域。

背景技術

在法醫學DNA基因分析領域，在很多情況如：空難、恐怖襲擊及多年陳舊檢材的DNA分析過程中，骨頭和牙齒通常是最好的但又是僅有的DNA分析資源。然而目前為止DNA的有效提取仍舊是法醫分析中的DNA分型中面臨的巨大難題，因為陳舊骨骼/牙齒檢材長期暴露于外界環境中，如高溫、潮濕、暴曬、土壤微生物等惡劣條件對DNA的產生嚴重破壞，導致DNA含量減少且降解程度嚴重，DNA分子可能被降解成很小的片段(甚至50bp以下)，此外陳舊牙齒和骨骼檢材中還存在大量PCR反應抑制劑和外源性污染，而且檢材的大范圍鈣化也會阻礙DNA的釋放。另外由于檢材用途的特殊性，提取方法需要快速高效且可以有效防止污染。

目前我們所采用的陳舊骨骼/牙齒檢材的DNA提取方法大致可分為酚/氯仿、異丙醇/氯仿等有機方法及硅膠提取等方式。這些方法中均存在著缺點，如有機提取法無法有效去除檢材樣本中的親水成分和PCR抑制劑而且該方式對操作人員的健康造成傷害。而硅膠顆粒用于DNA提取其本身也是一種抑制劑。目前對于陳舊骨頭和牙齒的DNA提取方法一直在發展但是仍沒有高效而又統一的標準流程。目前亟需要一種快速高效并且操作簡單可以盡可能減少污染的方法，以便于后續一代、二代的DNA測序和準確分型，有效運用于法醫的身份鑒定。

發明內容

本發明公開了一種骨骼和牙齒DNA磁珠提取方法和試劑，特別是針對陳舊檢材的DNA提取。該方法能高效、快速地獲得高質量的骨骼/牙齒檢材DNA，可以滿足PCR擴增、定量和定性分析、測序等分子生物學實驗及法醫科學DNA分型及應用要求。

為實現本發明的目的，本發明采用的技術方案是：

1.步驟一：骨骼或牙齒DNA磁珠提取方法試劑配制

預處理脫鈣液A：0.2-0.8M乙二胺四乙酸(EDTA)；

消化液B：0.3-0.6％(w/v)N-月桂酰肌氨酸鈉鹽(NLS)，0.2-0.5M乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.40-0.70mg/ml蛋白酶K，0.02-0.05M，二硫蘇糖醇(DTT)；

磁珠懸浮液：15-30％(w/v)納米磁珠；

結合液C：35-50％(v/v)異丙醇，2.0-4.0M鹽酸胍，0.5-1.5mg磁珠；

洗滌液W1：5-10mM氯化鈣，70-90％(v/v)乙醇，洗滌液W2：70-90％(v/v)乙醇；

洗脫液T：0.5×TE(Tris-EDTA)，pH＝7.0-9.0。

2.步驟二：對骨骼或牙齒檢材進行脫鈣預處理

取骨骼或牙齒檢材粉末1.0g置于15ml離心管中，加入脫鈣預處理液A，在30-45℃條件下于旋轉混合儀中避光處理1.0-2.0小時，脫鈣預處理液A：0.2-0.8M乙二胺四乙酸(EDTA)。由于骨骼和牙齒檢材存在大范圍鈣化情況，會阻礙提取試劑的進入和檢材細胞中DNA的釋放，因此需通過脫鈣的方式破壞鈣化結構，使提取試劑更好的進入細胞，破壞細胞結構有助于細胞內DNA的釋放提高提取效果。