[發(fā)明專利]一種對細(xì)胞中X染色體定量檢測的方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710042837.6
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108330187B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙欣之;張強(qiáng);郭曉紅;田天;王騰
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種對細(xì)胞中X染色體定量的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法包括：1)以X染色體上多個(gè)中具有多個(gè)X染色體失活特異的DNA差異甲基化位點(diǎn)（XIDMSs）的區(qū)域（XIDMRs）為探針，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；2)建立正常男性和女性樣品中各探針和全X染色體的拷貝數(shù)參考值范圍；和3)檢測和分析未知核型細(xì)胞中X染色體數(shù)量與結(jié)構(gòu)信息。本發(fā)明的試劑盒包含：1）對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的試劑；2）對探針區(qū)域PCR擴(kuò)增的引物和試劑；以及3）對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行甲基化檢測的引物和試劑。本發(fā)明可以有效地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中是否存在X染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常以及異常的種類。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和試劑檢測領(lǐng)域,涉及X染色體定量檢測法及試劑盒。具體涉及一種對細(xì)胞中X染色體定量檢測的方法以及一種基于該方法的試劑盒。尤其涉及基于X染色體失活特異的DNA差異甲基化區(qū)域的對細(xì)胞中X染色體定量檢測的方法以及試劑盒。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開了人類體細(xì)胞中包含23對染色體，其中有22對常染色體，1對性染色體。性染色體包括X染色體和Y染色體，可以決定性別：正常男性的性染色體為XY，包含1條X染色體，而正常女性的性染色體為XX，包含2條X染色體。X染色體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常與多種性染色體疾病相關(guān)，包括克蘭費(fèi)爾特綜合征（Klinefelter syndrome），特納綜合征（Turnersyndrome），X三體綜合征（Trisomy X syndrome）等。對細(xì)胞中X染色體進(jìn)行定量檢測獲取細(xì)胞中X染色體的數(shù)量與結(jié)構(gòu)信息，可為多種性染色體疾病的診斷提供重要的中間結(jié)果。

現(xiàn)有技術(shù)方法中，核型分析可以準(zhǔn)確獲知細(xì)胞中X染色體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)信息，在臨床和科研中廣泛應(yīng)用，但該方法需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，周期較長；并需要有經(jīng)驗(yàn)的檢測人員觀測識別，難以大規(guī)模開展；高通量遺傳檢測技術(shù)，如比較基因組雜交芯片、單核苷酸多態(tài)性分型芯片和和全基因組測序技術(shù)成本較過高；常規(guī)分子遺傳學(xué)檢測方法，如熒光定量PCR、毛細(xì)管電泳等難以檢測疾病中高發(fā)的嵌合體和結(jié)構(gòu)異常情況。

研究公開了男性和女性體細(xì)胞中X染色體數(shù)量不同，需要通過劑量補(bǔ)償（dosagecompensation）機(jī)制維持多數(shù)X連鎖基因在不同性別間的轉(zhuǎn)錄水平相同或接近。在人類和哺乳動(dòng)物中，這種劑量補(bǔ)償是通過X染色體失活（X chromosome inactivation）完成，即女性體細(xì)胞中隨機(jī)有1條X染色體處于失活狀態(tài)（Xi），失活的X染色體上約有80%的基因失去轉(zhuǎn)錄活性；研究顯示，X染色體失活發(fā)生在胚胎發(fā)育時(shí)期，非常穩(wěn)定，可維持終身，其分子機(jī)制是通過表觀遺傳修飾，包括DNA甲基化、非編碼RNA和組蛋白修飾的改變完成。X染色體失活符合n-1原則，即無論細(xì)胞中有幾條X染色體，除了1條X染色體保持轉(zhuǎn)錄活性（Xa），其它X染色體均失活。

研究還公開了DNA甲基化參與X染色體失活過程。在人類和哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要是CpG二核苷酸序列上的胞嘧啶（C）堿基中5號碳原子上的氫原子（H）被一個(gè)甲基（-CH₃）取代；CpG二核苷酸在基因啟動(dòng)子區(qū)往往成簇存在，形成CpG島，啟動(dòng)子區(qū)的CpG島的DNA甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，通常低甲基化表明基因處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)，高甲基化則處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)；在失活X染色體上，失活目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)，而活化的X染色體上相應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)則處于低甲基化狀態(tài)。

有關(guān)研究通過比較男性和女性樣品中X染色體上CpG位點(diǎn)的甲基化水平，可以鑒定X染色體失活特異的DNA差異甲基化位點(diǎn)（XIDMS），這些CpG位點(diǎn)在活化X染色體上未甲基化，而僅在失活染色體中高度甲基化，且主要定位于失活目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)，并成簇存在，形成X染色體失活特異的DNA差異甲基化區(qū)域（XIDMR），基于此，可通過對相關(guān)區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)的定量分析，獲取細(xì)胞中X染色體的定量信息。

基于現(xiàn)有技術(shù)的研究現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種對人類細(xì)胞中X染色體定量的方法，以及對人類細(xì)胞中X染色體定量檢測的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容