[發(fā)明專利]一種高活性木瓜蛋白酶的制備工藝

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• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106754834A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范遠景;龔濤;劉培志;王明和;姚勇;徐柳;楊簦玲;婁鵬祥;童今注
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50
• 代理公司: 合肥金安專利事務(wù)所34114
• 代理人: 金惠貞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高活性木瓜蛋白酶的制備工藝。

背景技術(shù)

宣木瓜，是貼梗海棠的成熟果實，屬于薔薇科木瓜屬灌木。是安徽著名的一種食品藥品特產(chǎn)，宣木瓜中的微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)的含量很多且種類較多，有“百益之果”的稱號。宣木瓜鮮重中含有約1. 1%的粗蛋白，其中還有結(jié)構(gòu)蛋白和生物功能蛋白，如大量蛋白酶類，富含有人體所需的大量必需氨基酸。在應(yīng)用方面，提取宣木瓜中的蛋白酶并純化，再生產(chǎn)成為嫩肉粉、飼料添加劑、餅干松化劑、啤酒澄清劑和水解動物蛋白系列等產(chǎn)品。

目前，木瓜中蛋白酶的制備工藝主要有1.鹽析沉淀法2.超濾法3.乙醇沉淀法。

鹽析沉淀法是通過改變中性無機鹽的濃度來改變蛋白質(zhì)的溶解度，同時給蛋白質(zhì)表面的水化膜造成破壞而引起蛋白質(zhì)的沉淀，這種工藝的作用條件比較溫和，能較大程度的保留酶的活性，但是沉淀物中會殘留較多的鹽析溶劑，不利于后續(xù)的純化

超濾法是一種先進的提取技術(shù)，是木瓜蛋白酶精制的方向，該工藝存在的問題是，由于木瓜漿液中含有膠質(zhì)、淀粉類物質(zhì)較多，攪拌提取工序木瓜酶溶解釋放不完全，后續(xù)板框濾渣較多，濾液不清；膜分離過濾階段由于濾膜孔徑小，會造成濾膜堵塞，過濾速度慢，影響木瓜蛋白酶的分離，生產(chǎn)過程中要停機對濾膜進行清洗，導(dǎo)致一部分酶的損失，降低了酶活。

乙醇沉淀法是木瓜蛋白酶初步提取純化的常用方式，乙醇提取木瓜蛋白酶，材料簡易，操作方便，分辨率較高，不需要用一些工藝來去除沉淀中的提取劑，只需自然揮發(fā)就可以，也可以用真空抽濾，但是乙醇法在提取過程中會降低蛋白酶的酶活。

纖維素酶和果膠酶可在溫和的條件下破碎植物細胞的細胞壁，與不加該酶處理的果肉勻漿相比，可顯著提高果實的出汁率，使細胞中的成分透過松散的細胞壁溶出。兩種酶按一定比例復(fù)合相比添加單一的酶可顯著提高果實的出汁率，提高木瓜蛋白的提取率。

蛋白酶提取，分離過程中其活性中心含有巰基的鍵容易發(fā)生氧化形成二硫鍵使酶失活，使制備的蛋白酶活性降低，影響其功能的發(fā)揮，L-cys與EDTA可以有效保護蛋白酶防止其被氧化，減少酶活損失，且兩者復(fù)合添加對酶活保護作用效果更好。

發(fā)明內(nèi)容

為了提高木瓜蛋白酶的提取率，同時顯著提高木瓜蛋白酶的活性，本發(fā)明提供一種高活性木瓜蛋白酶的制備工藝。

一種高活性木瓜蛋白酶為木瓜蛋白酶的粗制產(chǎn)品，為淺黃色粉末，水溶性良好，酶活達到1.55萬U/g。

制備一種高活性木瓜蛋白酶的具體操作步驟如下：

（1）制備宣木瓜漿

將新鮮宣木瓜洗凈，去皮、去仔，分割成小塊，按質(zhì)量比1：1加入蒸餾水，榨汁；得到宣木瓜漿；

（2）制備宣木瓜汁

在宣木瓜漿中加入復(fù)合酶，攪拌均勻，在溫度40～50℃條件下酶解反應(yīng)1.5～2h，得到酶解宣木瓜汁；所述復(fù)合酶由纖維素酶和果膠酶組成，復(fù)合酶的加入量為宣木瓜漿質(zhì)量的0.6～1.2%；

（3）抽濾

將酶解宣木瓜汁抽濾去除濾渣，得新鮮宣木瓜汁；

（4）離心分離

將新鮮宣木瓜汁離心分離，取上清液，溫度1～4℃條件下冷藏備用；

（5）制備復(fù)合溶液

在上清液中加入濃度75%的乙醇和復(fù)合保護劑，用濃度0.1mol/L的氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié)pH值為6.0-8.0，靜置10～12h，得到復(fù)合溶液；

所述復(fù)合保護劑由半胱氨酸（L-cys）和乙二胺四乙酸（EDTA）組成；

（6）制備木瓜蛋白酶

將復(fù)合溶液離心取沉淀，冷凍干燥至恒重，得到木瓜蛋白酶。

進一步限定的技術(shù)方案如下：

步驟（1）中，榨汁時間為3min。

步驟（2）中，纖維素酶的酶活為5萬U/g，果膠酶的酶活為10萬U/g；復(fù)合酶中纖維素酶：果膠酶的質(zhì)量比為8:1。

步驟（3）中，抽濾過120目雙層濾布。

步驟（4）中，離心分離的轉(zhuǎn)速為3500rpm，時間為15min。

步驟（5）中，按1：1的體積比在上清液中加入濃度75%的乙醇；半胱氨酸（L-cys）的添加量為0.06mol/L，乙二胺四乙酸（EDTA）的添加量為0.004mol/L。

步驟（6）中，離心分離的轉(zhuǎn)速為5500rpm，時間為10～15min；冷凍干燥溫度為﹣40℃。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面：

1.本發(fā)明操作流程簡單，能提高蛋白酶的提取率，添加復(fù)合酶與酶活保護劑顯著提高了木瓜蛋白酶的活性，木瓜蛋白酶的酶活達到1.55萬U/g。