[發明專利]一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法

在審

• 申請號: 201710040860.1
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106841139A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 何丹農;徐艷;樊春海;李迪;王萍;金彩虹
• 申請（專利權）人: 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所31121
• 代理人: 唐莉莎

技術領域

本發明涉及一種利用單分子熒光顯微術檢測過氧化氫含量的方法。本發明屬于生物傳感檢測領域。

背景技術

區別于傳統的光學成像，單分子檢測技術的出現將成像方式推新至新的階段：揭示隱藏在整體平均水平下分子的不均一性和其獨特的動態過程。利用單分子熒光顯微術，能夠發現分子間的差異及分子與其所處微納環境的相互作用，并且通過對單個分子的實時追蹤，可以得到單個分子實時的動態變化。基于此方法，多種酶分子與無機納米催化劑的催化特性被解析（Science 1998，Nature Materials 2008等）。同時單分子熒光檢測方法具有極佳的信噪比、檢測靈敏度及極高的時間分辨率，因而也被應用至核酸檢測方面（Nature Communication 2015）。

過氧化氫（H₂O₂）在調控細胞內許多重要的生理進，在生命系統、宿主防御以及細胞信號轉導起著的雙重作用，因而在最近的報道中被稱為是“必須的惡魔”。由于H₂O₂的重要功能，滴定，熒光測定，電化學方法等方法被用于開發新的H₂O₂檢測的策略。其中，電化學方法具有直接并且實時的檢測的優點，然而，傳統的電化學傳感方法很難提供細胞內的空間信息及成像信息。一些對H₂O₂非常敏感的熒光分子也被用來作為細胞內或細胞外檢測的探針。但是這些熒光發色團很容易被漂白，因此很難在生理環境中對H₂O₂含量的動態變化進行長時間觀測。因此目前迫切需要一種靈敏、成像清晰、實時的檢測方法。

發明內容

本發明針對現有檢測方案靈敏度、信噪比、成像方面存在的問題，提出利用利用單分子熒光顯微術結合核酶（DNAzyme）開發一種靈敏的檢測過氧化氫的方法。該方法可對檢測過程進行實時成像追蹤，并可捕獲單個產物生成過程。

在本發明的技術方案中，采用核酶G-四聯體（G-quadruplex）固定在玻片上，追蹤其催化Amplex Red生成熒光產物試鹵靈的反應進行信號采集。

本發明的方法具體為：

一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）核酶結構的生成

將一定比例的G-四聯體DNA與Cy 5、生物素雙修飾的固定鏈混合均勻，于95℃孵育10 min，緩慢降溫，使G-四聯體與固定鏈雜交并形成四聯體結構，得到復合物Ⅰ；

（2）核酶在玻片上固定

稀釋復合物Ⅰ至一定濃度后，與血晶素（hemin）以一定比例于25℃孵育一段時間，得到復合物Ⅱ；將復合物Ⅱ與鏈霉親和素修飾的玻片孵育一定時間后，緩沖液沖洗干凈過量復合物；

（3）利用單分子熒光顯微鏡追蹤監測過程

在玻片上滴加100微升反應液，反應液包括一定濃度的過氧化氫及Amplex Red；采用單分子熒光顯微鏡實時觀測復合物Ⅱ催化無熒光Amplex Red 生成熒光產物試鹵靈（resorufin）的過程。

所采用的緩沖液為本領域常規緩沖溶液，優選的緩沖溶為含有pH=7.4、100 mM K Cl、10 mM 磷酸鹽緩沖液。

所采用的G-四聯體DNA為本領域常規的G-四聯體DNA序列，優選的為DNA序列表中序列；所采用的G-四聯體DNA與固定鏈的比例可以為本領域常規的比例，優選的比例為1:1。

所采用的稀釋復合物Ⅰ濃度至10^-11-10^-9 M，優選的濃度為5×10^-11 M；所采用的復合物Ⅰ與血晶素孵育比例可以為本領域常規的比例，優選的比例為2:1。

所采用的復合物Ⅰ與血晶素孵育時間可以為本領域常規的時間，優選的時間為20 min。

所采用的鏈霉親和素修飾的蓋玻片步驟參考2008年5月29日發表在Nature Methods第5期第6卷第507-516頁的題為A practical guide to single-molecule FRET的論文Supporting Online Information中的S6所記載的修飾方法；所采用的復合物Ⅱ與鏈霉親和素修飾的蓋玻片的孵育時間可以為本領域常規的時間，優選的時間為10 min。