[發(fā)明專利]一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710040860.1
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106841139A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何丹農(nóng);徐艷;樊春海;李迪;王萍;金彩虹
• 申請（專利權(quán)）人: 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海東方易知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所31121
• 代理人: 唐莉莎

1.一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）核酶結(jié)構(gòu)的生成

將一定比例的G-四聯(lián)體DNA與Cy 5、生物素雙修飾的固定鏈混合均勻，于95℃孵育10 min，緩慢降溫，使G-四聯(lián)體與固定鏈雜交并形成四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，得到復(fù)合物Ⅰ；

（2）核酶在玻片上固定

稀釋復(fù)合物Ⅰ至一定濃度后，與血晶素（hemin）以一定比例于25℃孵育一段時間，得到復(fù)合物Ⅱ；將復(fù)合物Ⅱ與鏈霉親和素修飾的玻片孵育一定時間后，緩沖液沖洗干凈過量復(fù)合物；

（3）利用單分子熒光顯微鏡追蹤監(jiān)測過程

在玻片上滴加100微升反應(yīng)液，反應(yīng)液包括一定濃度的過氧化氫及Amplex Red；采用單分子熒光顯微鏡實時觀測復(fù)合物Ⅱ催化無熒光Amplex Red 生成熒光產(chǎn)物試鹵靈（resorufin）的過程。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于，所采用的緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)緩沖溶液，優(yōu)選的緩沖溶為含有pH=7.4、100 mM K Cl、10 mM 磷酸鹽緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于，所采用的G-四聯(lián)體DNA為本領(lǐng)域常規(guī)的G-四聯(lián)體DNA序列，優(yōu)選的為DNA序列表中序列；所采用的G-四聯(lián)體DNA與固定鏈的比例可以為本領(lǐng)域常規(guī)的比例，優(yōu)選的比例為1:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于， 所采用的稀釋復(fù)合物Ⅰ濃度至10^-11-10^-9 M，優(yōu)選的濃度為5×10^-11 M；所采用的復(fù)合物Ⅰ與血晶素孵育比例可以為本領(lǐng)域常規(guī)的比例，優(yōu)選的比例為2:1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于， 所采用的復(fù)合物Ⅰ與血晶素孵育時間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時間，優(yōu)選的時間為20 min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于，所采用的復(fù)合物Ⅱ與鏈霉親和素修飾的蓋玻片的孵育時間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時間，優(yōu)選的時間為10 min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于所采用的所采用的單分子熒光顯微鏡為本領(lǐng)域常規(guī)顯微鏡，優(yōu)選的為全內(nèi)反射熒光顯微鏡，所述的單分子熒光顯微鏡成像參數(shù)可以為本領(lǐng)域常規(guī)的參數(shù)，較佳的647、561 nm激光控制在5 %左右，較佳的曝光時間控制在30-50 ms；所述的單分子熒光顯微鏡成像條件可以為本領(lǐng)域常規(guī)的條件，較佳的成像溫度控制在20 ℃左右，所述成像的濕度控制在50 %以下。

8.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于所采用的Amplex Red 濃度范圍控制在100-200 nM，優(yōu)選的濃度為100 nM。

9.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于數(shù)據(jù)采集時，首先利用Cy 5熒光分子確定復(fù)合物Ⅱ的位置，而生產(chǎn)的熒光產(chǎn)物在561 nm激光激發(fā)，當(dāng)二者可以共定位時，采集熒光產(chǎn)物隨時間變化的曲線。

10.根據(jù)權(quán)利要求1的一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法，其特征在于，最低可檢測到100 pM的H₂O₂。