[發明專利]檢測人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒及反應體系

在審

• 申請號: 201710040498.8
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106801091A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 閻海;王思振;焦宇辰;鄭延軍;徐大勇;鄭喬松
• 申請（專利權）人: 北京泛生子基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司11279
• 代理人: 田昕,司麗春

技術領域

本發明涉及一種檢測基因突變的試劑盒、反應體系及方法，特別涉及一種檢測人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒、反應體系及方法。

背景技術

一直以來肺癌都位居全球癌癥相關死亡的首位。世界衛生組織國際癌癥研究署發布的癌癥報告顯示：全球肺癌新發病例預測約161萬例，死亡約138萬例，分別占惡性腫瘤新發病例及死亡病例的13％及18％，居惡性腫瘤第一位，其中非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。盡管肺癌的診斷方法和治療手段不斷提高，肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的預后較差，5年生存率仍<20％。

人類表皮生長因子受體家族(epidermal growth factor receptor family,EGFR家族)屬于酪氨酸激酶受體家族，是一種多功能糖蛋白，其廣泛分布于人體各組織細胞膜上，是原癌基因的表達產物，其基因位于第七號染色體短臂上(7p12)，由188.307K個堿基組成，共有28個外顯子，EGFR具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)區，其是傳遞胞外信號到胞內的重要途經蛋白，并由外顯子18.24編碼。EGFR家族成員的結構相似，都包括胞外段、跨膜區和胞內段三部分。胞外段為受體與配體結合部，跨膜段為疏水部，將受體固定于細胞膜上，胞內區有典型的ATP結合位點和酪氨酸激酶區，其酪氨酸激酶活性在調節細胞增殖及分化中起著至關重要的作用。當配體與受體結合后，引起受體的二聚化作用，形成同型或異型二聚體，二聚化的受體發生交聯磷酸化，即一個受體和另外一個受體上特定的酪氨酸殘基磷酸化，激活胞內區的TK亞區，從而激發下一級信號傳導。非小細胞肺癌EGFR突變85％以上發生在外顯子19的缺失突變及外顯子21的L858R點突變。

近年來，表皮細胞生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKIs)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被證明對具有EGFR激活突變的晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者具有顯著療效，EGFR-TKI成為非小細胞肺癌治療的里程碑。但同時，幾乎所有初始時對EGFR-TKI反應良好的患者會在6-12個月內出現耐藥、疾病進展，稱為“獲得性耐藥”。

許多研究已證實EGFR的突變狀態決定了腫瘤對EGFR-TKI的反應，研究表明EGFR-TKI藥物對于EGFR L858R和EGFR外顯子19缺失突變的患者作用顯著，尤其是EGFR基因外顯子19發生缺失突變的非小細胞肺癌患者對該類藥物敏感，即受體酪氨酸激酶抑制劑藥物對這些患者有療效。因此EGFR外顯子exon19缺失突變準確的檢測，可以為篩選靶向治療患者提供參考；同時可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測。但外顯子19缺失突變主要是發生9、12、15、18、24個核苷酸的框內缺失突變，其缺失形式較多，為檢測其缺失情況帶來一定困難。

目前檢測EGFR基因突變最常用的樣本來源是腫瘤的病理組織或細胞學標本，但是組織取材均為有創操作，有時難以實施，且這些操作受腫瘤大小、部位、患者一般情況等影響，有時不能取得滿意的組織或組織量太少不能進行基因突變檢測。并且隨著疾病的進展和EGFR-TKIs耐藥性的出現，常常需要再次進行分子生物學檢測，而組織取材為有創操作，不能便捷、反復進行。近些年血漿游離DNA(ctDNA)被認為是一種可能代替腫瘤組織用來檢測腫瘤特異性改變的樣本。腫瘤組織、腫瘤細胞壞死及脫落的腫瘤細胞進入血液后凋亡釋放游離DNA進入外周血。ctDNA用于腫瘤突變檢測優勢在于：操作無創；在疾病的任一進程中都可獲?。豢梢宰鳛橐环N腫瘤標記物，實現實時檢測和動態監測；克服腫瘤組織的異質性。因此，使用外周血游離DNA監測患者EGFR基因突變狀態，探索患者EGFR-TKI耐藥機制及預測預后成為一條可行的途徑。然而，目前使用ctDNA檢測EGFR基因突變仍有一些技術上的挑戰。1)ctDNA含量因人而異，并且大多數人含量較低；2)ctDNA片段相對小，約為180bp：3)ctDNA中腫瘤相關的DNA所占比例不同人差別較大，并且常因比例小而難以測出；4)以前的研究顯示，與腫瘤組織相比，ctDNA檢測EGFR突變靈敏度僅為43-66％。因此，高靈敏度的ctDNA EGFR基因突變檢測技術的發展十分重要。

綜上所述，本領域迫切需要一種能夠基于非腫瘤組織，高靈敏度、高準確性和高可靠性地檢測患者中EGFR外顯子19缺失突變的方法。