[發明專利]檢測人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒及反應體系

在審

• 申請號: 201710040498.8
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106801091A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 閻海;王思振;焦宇辰;鄭延軍;徐大勇;鄭喬松
• 申請（專利權）人: 北京泛生子基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司11279
• 代理人: 田昕,司麗春

1.一種檢測人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒，其特征在于，包括：具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的檢測外顯子19缺失突變的熒光探針和具有如SEQ ID NO:4所示序列的檢測擴增后總DNA的熒光探針。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物、檢測外顯子19缺失突變的熒光探針和檢測擴增后總DNA的熒光探針均存在于引物探針混合液中。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述上游引物在引物探針混合液中的濃度為12μM，所述下游引物在引物探針混合液中的濃度為12μM，所述檢測外顯子19缺失突變的熒光探針在引物探針混合液中的濃度為3μM，所述檢測擴增后總DNA的熒光探針在引物探針混合液中的濃度為3μM。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括數字PCR反應預混液，優選QuantStudio^TM3D Digital PCR Master Mix v2。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括陽性質控品，所述陽性質控品通過以下方式制備獲得：將EGFR基因外顯子19缺失突變細胞系基因組DNA與野生型細胞系基因組DNA混合后使含EGFR基因外顯子19缺失突變的DNA比例占總DNA的約1.0％，將所得混合DNA加到Covaris超聲管中并進行超聲處理，獲得打斷成為與ctDNA片段長度接近的180bp左右的片段化DNA。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括陰性質控品，所述陰性質控品通過以下方式制備獲得：將不含有EGFR外顯子19缺失突變的EGFR野生型細胞系基因組DNA加到Covaris超聲管中并進行超聲處理，獲得打斷成為與ctDNA片段長度接近的180bp左右的片段化DNA。

7.一種檢測人類EGFR基因外顯子19缺失突變的PCR反應體系，其特征在于，包括：

8.根據權利要求6所述的PCR反應體系，其特征在于，所述DNA模板的來源為腫瘤組織中提取的DNA或血漿游離DNA，尤其是血漿游離DNA。

9.一種檢測人類EGFR基因外顯子19缺失突變的芯片式數字PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)配制權利要求7所述檢測人類EGFR基因外顯子19缺失突變的PCR反應體系；

2)把反應體系上樣到數字PCR芯片中；

3)把數字PCR芯片放入專用PCR儀中，進行PCR擴增；

4)從專用PCR儀中取出芯片并放至室溫后，將芯片放入芯片掃描儀中掃描熒光信號；

5)計算機根據熒光信號計算突變比例。

10.根據權利要求9所述的芯片式數字PCR方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序為：(1)96℃，10min；(2)繼續進行39個循環，每個循環包括57℃進行2min，然后98℃進行30sec；(3)39個循環之后在57℃進行2min，之后10℃下保持不超過12小時。