[發明專利]用于人KRAS基因突變檢測的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201710040408.5
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108330191A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 馬永;丁燕芬;丁娜
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司;常州京森生物醫藥研究所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種人KRAS基因突變檢測的引物、探針及試劑盒。發明篩選的特異性ARMS引物及探針，及優化的反應體系，能夠獲得檢測性能優異的用于人KRAS基因突變檢測的試劑盒，該試劑盒檢測快速，90分鐘即可完成檢測；靈敏度高，可以檢測10ngDNA樣品中含量低至1％的KRAS基因突變；特異性高，與野生型樣品無擴增；操作簡便，成本低廉，有利于規模化，市場化。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種人KRAS基因突變檢測的引物、探針及試劑盒。

背景技術

Ras基因是一種原癌基因，包括NRas、HRas和KRas。大量臨床研究資料證實，在肺癌患者中KRAS的突變率為15-30％，在結直腸癌患者中的突變率為20-50％，導致KRAS突變的位點主要位于第12、13密碼子。KRAS基因突變與結直腸癌、肺癌的絡氨酸激酶抑制劑等靶向藥物的原發性耐藥有關。

臨床上靶向新藥愛必妥(Erbitux，西妥昔單抗)和帕尼單抗(Panitumumab)僅適用于無突變的KRAS基因野生型患者，對KRAS突變患者無效。Ras基因的檢測不僅可以深入了解癌基因的情況，更重要的是篩選出針對抗EGFR靶向治療藥物有效的癌癥患者，幫助醫生選擇對腫瘤病人最有效的治療方法，從而真正實現腫瘤病人的個體化治療，還能大幅減少相關治療費用和毒副作用。目前在歐美某些癌癥內科治療前已經常規檢測Ras狀態，并且成為能否報銷相關抗EGFR治療費用的憑據。

現有的基因突變檢測方法主要有直接測序、限制性小片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、高分辨率溶解曲線分析(HighResolution Melting Curve Analysis，HRM)等。直接測序法靈敏度較低，檢測周期長，成本高昂，通量不高，而且是非閉管反應，難以避免交叉污染。RFLP法存在檢測周期長，操作繁瑣，成本高昂，易污染等不足。HRM法同樣存在操作復雜，難以避免污染等缺點。

本申請采用擴增阻滯突變系統技術(Amplification Refractpry MutationSystem，ARMS)與Taqman探針相結合的方法檢測KRAS基因突變。擴增阻滯突變系統又名等位基因特異PCR，是基于PCR技術檢測點突變或多態性的技術，ARMS引物的3’末端設計在突變位點，最后一個堿基與突變的堿基配對；采用無3’-5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶，可特異性地識別引物3’末端，只有引物3’末端完全配對時，才能正常擴增，當引物3’末端發生錯配時，不能有效擴增。對于替換突變，在使用ARMS引物時，由于野生型與突變型只有一個堿基的差別，當野生型模板含量高時，可能發生無效的引物結合，由此產生非特異性擴增。因此，在引物3’端再人為引入一個錯配堿基，這樣野生型模板即有兩個錯配堿基，可大大提高引物對突變型模板的特異性；對突變型模板只有一個錯配堿基，且不在3’末端，通過實驗，可篩選與突變模板具有高結合效率的引物。采用ARMS方法可針對已知突變設計合適的引物，并選擇性地擴增突變基因。

Taqman探針是在Real-time PCR技術基礎上發展出來的熒光檢測技術，是高度特異的定量PCR技術，其原理是利用Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性切斷探針，從而產生熒光信號。原始的探針5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團，探針完整時，淬滅基團吸收報告基團的熒光能量，探針不發光，儀器不能檢測出熒光信號。在熒光定量PCR反應過程中，如果模板DNA沒有與探針發生互補配對，探針兩端基團保持原樣，同樣不能檢測到熒光信號。隨著PCR擴增的進行，模板DNA與探針發生互補配對，探針被Taq酶的3’-5’外切酶活性所切斷，報告基團與淬滅基團遠離，發出的熒光信號可由儀器檢測到。由于探針與模板特異性結合，熒光信號的強弱就代表了PCR產物的多少，累積的熒光信號強度和PCR產物的量同步，即發出的熒光的量與擴增反應的循環數呈線性關系。Taqman探針的的優點在于能夠區分非特異性擴增和目的片段的擴增。